ピペットチップやEPチューブなどの滅菌。

1. 0.1% (1,000 分の 1) DEPC (猛毒物質) を脱イオン水で調製し、ドラフト内で慎重に使用し、光を避けて 4°C で保管します。

DEPC水とは、純水をDEPC処理し、高温高圧滅菌したものです。RNase、DNase、プロテイナーゼが含まれていないことがテスト済みです。

2. ピペット チップと EP チューブを 0.1% DEPC に入れ、ピペット チップと EP チューブが 0.1% DEP で満たされていることを確認します。

3. 光を避けて一晩放置します（12～24時間）

4. チップと EP チューブが入った箱を DEPC に浸す必要はありません。チップやEPチューブ内のDEPC水を大まかに取り除いた後、梱包してラップをしてください。

5. 121℃、30分

6. 180℃、数時間（少なくとも3時間）乾燥させます。

注:DEPC を扱うときは、ラテックス手袋とマスクを着用してください。b、またはDEPC滅菌なし、130℃、90分間オートクレーブ（多くの研究室では高温滅菌を2回）

RNA 抽出に関する考慮事項

組織 RNA 分離失敗の 2 つの主な現象

RNAの分解と組織内の不純物の残留、分解については、まず培養細胞から抽出したRNAがなぜ分解されにくいのかを見てみましょう。既存の RNA 抽出試薬にはすべて、RNase を急速に阻害する成分が含まれています。培養細胞にライセートを加えて混合するだけで、すべての細胞がライセートと完全に混合され、細胞が完全に溶解されます。細胞が溶解すると、ライセート中の有効成分が細胞内の RNase を直ちに阻害するため、RNA はそのまま残ります。つまり、培養細胞はライセートと容易かつ完全に接触するため、その RNA は容易には分解されません。一方、組織内の細胞はライセートに迅速に接触するのが難しいため、組織内の RNA は容易に分解されます。十分な接触があったため。それで、RNA活性を阻害しながら組織を単一細胞に変える方法があると仮定すると、分解の問題は完全に解決される可能性があります。

液体窒素粉砕はそのような方法で最も効果的です。しかし、液体窒素ミリング法は、特にサンプル数が多い場合には非常に手間がかかります。これにより、次善の手段であるホモジナイザーが誕生しました。のホモジナイザーこの方法は、細胞がライセートと接触する前にRNase活性がどのように阻害されるかという問題を考慮しておらず、むしろ組織破壊の速度が細胞内RNaseがRNを分解する速度よりも速いことを祈っています。

電気ホモジナイザーの効果がより優れており、ガラスホモジナイザーの効果は乏しいですが、一般にホモジナイザー法では劣化現象を防ぐことはできません。したがって、抽出液が劣化した場合は、元の電気ホモジナイザーを使用して液体窒素で粉砕する必要があります。元のガラスホモジナイザーを電気ホモジナイザーに変更するか、液体窒素で直接粉砕する必要があります。この問題はほぼ 100% 実現可能です。解決する。

その後の実験に影響を与える不純物残留問題には、劣化よりもさらに多様な原因があり、それに応じて解決策も異なります。結論は、組織内に分解または残留不純物がある場合、特定の実験材料の抽出方法/試薬を最適化する必要があります。最適化のために貴重なサンプルを使用する必要はありません。魚や鶏肉などの小動物を市場から購入し、材料の対応する部分を RNA 抽出用に取り、残りの部分をタンパク質抽出用に取り、口、胃、腸で粉砕して抽出します。

抽出された RNA のターゲット RNA はさまざまな追跡実験に使用され、その品質要件も異なります。

cDNA ライブラリの構築には、酵素反応阻害剤の残基がない RNA の完全性が必要です。ノーザンでは、より高い RNA 完全性が必要であり、酵素反応阻害剤残基の要件が低くなります。RT-PCR は RNA の高度な完全性を必要としません。しかし、酵素反応を阻害します。残留要件は厳しいです。入力が出力を決定します。最高純度の RNA を取得することが目標になるたびに、人員と費用がかかります。

サンプルの収集・保管

分解に影響を与える要因 サンプルが生体/または元の増殖環境から離れた後、サンプル内の内因性酵素が RNA を分解し始めます。そして分解速度は内因性酵素の含有量と温度に関係します。従来、内因性酵素活性を完全に阻害するには 2 つの方法しかありません。ライセートを直ちに添加し、徹底的かつ迅速に均質化することです。小さく切り、すぐに液体窒素で凍らせます。どちらのアプローチも高速な操作を必要とします。後者はすべてのサンプルに適していますが、前者は細胞および内因性酵素の含有量が低く、均質化が容易な組織にのみ適しています。具体的には、植物組織、肝臓、胸腺、膵臓、脾臓、脳、脂肪、筋肉組織などは、作業を進める前に液体窒素で凍結するのが最適です。

サンプルの断片化と均質化

分解と収量に影響を与える要因 サンプルの断片化は徹底した均質化のため、これはRNAを完全かつ完全に放出するためのものです。細胞を壊すことなく直接ホモジナイズできます。組織は破壊された後にのみ均質化できます。酵母と細菌は、均質化する前に、対応する酵素で破壊する必要があります。内因性酵素含量が低く、均質化が容易な組織は、ホモジナイザーによってライセート中で一度に破砕および均質化できます。植物組織、肝臓、胸腺、膵臓、脾臓、脳、脂肪、筋肉組織およびその他のサンプル。内因性酵素が多く含まれているか、容易に均質化されません。そのため、組織の破壊と均質化は別々に実行する必要があります。最も信頼性が高く生産性の高い断片化方法は液体窒素を使用した粉砕であり、最も信頼性の高い均質化方法は電気ホモジナイザーの使用です。液体窒素を使用した粉砕に関する特別な注意事項: 凍結すると内因性酵素が機能しやすくなるため、粉砕プロセス全体を通じてサンプルを解凍してはなりません。

ライセートの選択

操作の利便性と残留内因性不純物の要因への影響 一般的に使用される溶解溶液は、RNase の活性をほぼ阻害する可能性があります。したがって、溶解溶液を選択する際の重要なポイントは、精製方法と組み合わせて考慮することです。例外が 1 つあります。内因性酵素含有量が高いサンプルの場合は、内因性酵素を不活化する能力を高めるためにフェノールを含むライセートを使用することをお勧めします。

精製方法の選択

残留内因性不純物、抽出速度に影響を与える要因 細胞などの清浄なサンプルの場合、ほとんどすべての精製方法で満足のいく結果が得られます。しかし、他の多くのサンプル、特に植物、肝臓、細菌などの不純物を多く含むサンプルの場合、適切な精製方法を選択することが重要です。カラム遠心精製法は抽出速度が速く、その後の RNA の酵素反応に影響を与える不純物を効果的に除去できますが、高価です (Foregene は費用対効果の高いキットを提供しています。詳細はクリックしてください)ここ);LiCl 沈殿などの経済的で古典的な精製方法を使用しても満足のいく結果が得られますが、操作時間は長くなります。。

RNA抽出の「3つのこだわりと8つのこだわり」

規律 1:外因性酵素の汚染に終止符を打ちます。

注1:マスクと手袋を厳重に着用してください。

注2:実験に使用した遠沈管、チップヘッド、ピペットロッド、電気泳動タンク、実験台などは徹底的に廃棄してください。

注3：実験に必要な試薬/溶液、特に水は RNase フリーでなければなりません。

規律 2:内因性酵素の活性をブロックする

注4:適切な均質化方法を選択してください。

注5:適切なライセートを選択してください。

注6:サンプルの開始量を制御します。

規律 3:抽出目的を明確にする

注7:ライセートシステムがサンプルの最大開始量に近づくと、抽出成功率は急激に低下します。

注8:RNA 抽出を成功させるための唯一の経済的基準は、収量ではなく、その後の実験の成功です。

RNase 汚染源トップ 10

1. 指は外因性酵素の最初の供給源であるため、手袋を頻繁に着用し、交換する必要があります。さらに、呼吸も酵素の重要な供給源となるため、マスクも着用する必要があります。手袋マスクを着用することのさらなる利点は、実験者を保護することです。

2. ピペットチップ、遠心管、ピペット – RNase は滅菌だけでは不活化できないため、ピペットチップと遠心管は、DEPC 処理済みとマークされている場合でも、DEPC で処理する必要があります。専用のピペットを使用し、使用前に、特にロッドを 75% アルコールの綿球で拭きます。また、ヘッドリムーバーは使用しないでください。

3. 水/バッファーには RNase 汚染があってはなりません。

4. 少なくともテストテーブルは 75% アルコールの綿球できれいに拭いてください。

5.内因性RNase すべての組織には内因性酵素が含まれているため、分解を軽減するには液体窒素で組織を急速凍結することが最善の方法です。液体窒素の保存/粉砕方法は確かに不便ですが、内因性酵素を多く含む組織にとってはこれが唯一の方法です。

6. RNA サンプル RNA 抽出製品には、微量の RNase 汚染が含まれる場合があります。

7. プラスミド抽出 プラスミド抽出では RNA を分解するために Rnase を使用することが多く、残った Rnase を Proteinase K で消化し、PCI で抽出する必要があります。

8. RNA の保存 低温で保存した場合でも、微量の RNase により RNA が分解されます。アルコールは低温ではすべての酵素活性を阻害するため、RNA の長期保存に最適な解決策は塩/アルコール懸濁液です。

9. 陽イオン（Ca、Mg）が含まれる場合、80℃で5分間加熱するとRNAが切断されてしまうため、RNAを加熱する必要がある場合には、保存液にキレート剤（1mMクエン酸ナトリウム、pH6.4）を添加する必要があります。

10. その後の実験で使用される酵素は、RNase によって汚染されている可能性があります。

RNA 抽出に関する 10 のヒント

1: RNase 活性を素早く阻止します。サンプルは採取後急速凍結され、溶解中の迅速な操作によりRNaseが不活性化されます。

2: リボザイム含有量が多い組織には適切な抽出方法を選択し、脂肪組織にはフェノールを含む方法を使用するのが最適です。

3: 予測品質にはノーザンが必要で、cDNA ライブラリー構築には高い完全性が必要ですが、RT-PCR および RPA (リボヌクレアーゼ保護アッセイ) には高い完全性は必要ありません。RT-PCR には高純度 (酵素阻害剤残基) が必要です。

4: 徹底した均質化が収率の向上と劣化の軽減の鍵となります。

5: RNA 電気泳動検出の完全性を確認します。28S: 18S = 2:1 は完全な記号であり、1:1 もほとんどの実験で許容されます。

6: RT-PCR、アレイ解析のための DNA の除去 DNA を除去するには Dnase I を使用するのが最善です。

7: 外因性酵素の汚染を軽減します – 酵素は外部から輸入できません。

8: 低濃度の核酸を濃縮する場合は、共沈試薬を添加する必要があります。ただし、酵素を含む共沈剤や DNA の汚染を防ぐためです。

9: RNA を完全に溶解し、必要に応じて 65℃ で 5 分間加熱します。

適切な保管方法

短期間なら-20℃、長期なら-80℃で保存できます。RNA 収量を向上させるための最初のステップは、サンプルごとに RNA 含有量が大きく異なることを認識することです。肝臓、膵臓、心臓などの高存在量（2～4ug/mg）、脳、胚、腎臓、肺、胸腺、卵巣などの中程度の存在量（0.05～2ug/mg）、膀胱、骨、脂肪などの低存在量（<0.05ug/mg）mg）。

1: 細胞を溶解して RN を放出します – RNA が放出されない場合、収量は減少します。電気的均質化は他の均質化方法よりも効果的ですが、液体窒素マッシング、酵素消化 (リゾチーム/リチカーゼ) などの他の方法と組み合わせる必要がある場合もあります。

2: 抽出方法の最適化。フェノールベースのメソッドの最大の問題は、不完全な層化と部分的な RNA の損失 (上清を完全に除去できない) です。不完全な層化は、核酸とタンパク質の含有量が多いことが原因であり、使用するライセートの量を増やすか、サンプルの量を減らすことで解決できます。脂肪組織にクロロホルム抽出のステップを追加しました。RNA の損失は、バックポンプを使用するか、有機層を除去してから遠心分離することによって減らすことができます。カラム遠心分離ベースのメソッドの最大の問題は、過剰なサンプルです。

古典的な抽出のヒント

1. フェノールの精製: 等量の 1:1 フェノール/クロロホルムを加え、1 ～ 2 分間激しく混合します。高速で 2 分間遠心分離します。上清 (80 ～ 90%) を注意深く除去します。決して中間層には到達しないでください。等量の反応溶液をフェノール/クロロホルムに加え、上清を除去します。収量を向上させるために、2 つの上清を混合して核酸を沈殿させることができます。混合するときは優しくしすぎたり、上澄みをすべて除去しようとしないでください。

2. 70 ～ 80% エタノールでの洗浄: 洗浄中、残留塩が確実に洗い流されるように、核酸を懸濁する必要があります。同時にエタノールを捨てた直後に数秒間高速遠心分離し、残ったエタノールをピペットで取り除きます。室温に5〜10分間放置した後、溶解します。

11.特殊組織の抽出

1. 線維組織: 心臓/骨格筋などの線維組織から RNA を抽出する鍵は、組織を完全に破壊することです。これらの組織は細胞密度が低いため、組織の単位重量あたりの RNA の量が少なく、できるだけ多くの開始量を使用することが最善です。凍結条件下では必ず組織を徹底的に粉砕してください。

2. タンパク質/脂肪含量が高い組織: 脳/植物性脂肪含量が高い。PCI 抽出後、上清には白い綿状の塊が含まれます。上清はクロロホルムで再抽出する必要があります。

3. 核酸/リボザイム含有量が高い組織: 脾臓/胸腺は核酸とリボザイム含有量が高くなります。凍結条件下で組織を粉砕し、その後急速に均質化すると、リボザイムを効果的に不活性化できます。ただし、ライセートの粘度が高すぎる場合 (核酸含量が高いため)、PCI 抽出は効果的に層別化できません。さらにライセートを追加すると、この問題を解決できます。複数の PCI 抽出により、より多くの残留 DNA を除去できます。アルコールを添加した直後に白い沈殿物が形成される場合は、DNA 汚染を示します。溶解後に酸性PCIで再抽出することでDNA汚染を除去できます。

4. 植物組織: 植物組織は動物組織よりも複雑です。一般に、植物は液体窒素条件下で粉砕されるため、内因性酵素による RNA の分解はまれです。劣化の問題が解決されない場合、その原因はほぼ確実にサンプルに含まれる不純物です。多くの植物に含まれる不純物は残留物をもたらしますが、残留物の原因は多くの場合、これらの不純物が RNA と類似点を持っているためです。つまり、あなたは沈殿し、私は沈殿し、あなたは吸着し、私は吸着します。これらの特徴により、それらは非常に強力な酵素阻害剤であることがわかります。

現在、市販の RNA 抽出試薬はわずかな調整でほぼすべての動物組織に適応できますが、ほとんどの植物組織に適した市販の RNA 抽出試薬はほとんどありません。幸いなことに、Foregene は特別なサービスを提供できます。植物RNA抽出キット、 我々は持っています植物トータル RNA 分離キット, Plant Total RNA Isolation kit Plus。後者は、多糖類とポリフェノールを多く含む植物用に特別に設計されています。RNA 抽出に関しては、ラボ ユーザーからのフィードバックが特に優れています。

12. サンプルの凍結と解凍の影響 凍結サンプルは大きくなる可能性があるため、RNA 抽出に使用する前に切断する必要があります。サンプルは切断中に（おそらく部分的に）溶ける傾向があります。凍結サンプルは RNA 抽出前に計量する必要がある場合があり、このプロセス中に必ず解凍が発生します。場合によっては、液体窒素の粉砕プロセス中にサンプルの解凍が発生することもあります。または、凍結サンプルを液体窒素で粉砕せずにライセートに直接添加すると、完全に均質化する前に解凍が確実に起こります。実験により、凍結組織は新鮮な組織よりも解凍中にRNAが分解されやすいことが示されています。考えられる理由: 凍結融解プロセスにより細胞内の構造が破壊され、内因性酵素が RNA と直接接触しやすくなります。

13. RNA の品質の判定 通常、RNA の完全性の判定には電気泳動が使用され、RNA の純度の判定には A260/A280 が使用されます。理論的には、無傷の RNA の比率は 28S:18S = 2.7:1 であり、ほとんどのデータは 28S:18S = 2:1 の比率を強調しています。実際、細胞以外のサンプルから抽出された RNA の比率が 2:1 のものはほとんどありません (これは Agilent Bioanalyzer を使用して取得されました)。

RNA の電気泳動結果は、二次構造、電気泳動条件、サンプル負荷、EB による飽和度などを含む多くの要因の影響を受けます。ネイティブ電気泳動を使用して RNA を検出し、DNA マーカーをコントロールとして使用します。2kb の 28S と 0.9kb の 18S が透明で、28S: 18S > 1 の場合、完全性はその後のほとんどの実験の要件を満たすことができます。

A260/A280 は多くの混乱を引き起こした指標です。まず第一に、核酸に関するこの指標の本来の意味を明確にする必要があります。純粋な RNA、その A260/280 = 約 2.0。純粋な RNA が「原因」であり、A260/A280 = 2 が「結果」です。今では誰もが A260/A280 を「原因」として使用し、「A260/A280 = 2 であれば RNA は純粋である」と考えており、当然のことながら混乱が生じます。

興味があれば、フェノール、イソチオシアン酸グアニジン、PEG など、抽出によく使用される少量の試薬を RNA サンプルに添加し、A260/A280 比を測定できます。実際には、RNA 抽出に使用される試薬の多くとサンプル中の多くの不純物が A260 および A280 付近を吸収し、A260/A280 に影響を与えます。

現時点で最も有益なアプローチは、RNA サンプルを 200 ～ 300 nm の範囲でスキャンすることです。純粋な RNA の曲線は、曲線が滑らかで、A230 と A260 に 2 つの変曲点があり、A300 が 0 に近く、A260/A280 = 2.0 付近、A260/A230 = 2.0 付近という特徴があります。スキャン データが利用できない場合は、A260/A230 比も決定する必要があります。この比は、酵素反応に影響を与えるすべての不純物のキャリーオーバーの影響をより受けやすいためです。デバイスの線形範囲 (A260 の場合は 0.1 ～ 0.5) を考慮してください。

他にも 2 つの有益な現象があります。A260/A280 を水中で測定すると、比は約 0.3 低くなります。一方、10 mM EDTA で測定した比率は、1 mM EDTA で測定した比率よりも約 0.2 高くなります。

関連製品：

中国植物トータル RNA 分離キットのメーカーとサプライヤー |フォアジーン (foreivd.com)

RNA 単離シリーズのサプライヤーと工場 |中国の RNA 単離シリーズ メーカー (foreivd.com)

RNA 単離シリーズ – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)