問題分析ガイド

以下は、遭遇する可能性のある問題の分析です。工場合計RNA extraction will help you with your experiments. In addition, for other experimental or technical problems in addition to operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. If you have any needs, please contact us at: 028-83360257 or E-mali : Tech@foregene.com.

スピンカラムが詰まっている

スピンカラムが詰まると、RNA 収量が低下したり、RNA を精製できなくなったり、得られる RNA の品質が低下します。

一般的な原因分析:

1. サンプルが完全に壊れていない。

サンプルの断片化が不完全だと DNA 洗浄カラムがブロックされる可能性があり、RNA の収量と品質にも影響を与える可能性があります。サンプルの断片化を行う際は、サンプルの細胞壁や細胞膜などの組織をできるだけ細かく砕くために、十分な量の液体窒素中で素早く粉砕することをお勧めします。ポリフェノール多糖類の植物サンプルには、Plant Total RNA Isolation Kit Plus の使用をお勧めします。

2. DNA クリーニングカラムで分離された上清を吸引し、細胞破片の可能性があるペレットを吸引します。

吸引された細胞破片ペレットは、RNA 吸着手順中に RNA のみのカラムに詰まる可能性があります (手順のステップ 5、多糖ポリフェノール手順のステップ 6 を参照)。この上清を吸引する際には、細胞破片が吸引されないよう注意することをお勧めします。

3. 初期サンプル量が多すぎます。

サンプルを過剰に使用すると、バッファー PRL1 またはバッファー PSL1 によるサンプルの断片化が不完全になったり、細胞の溶解が不完全になったりして、精製操作用の精製カラムが詰まることがあります。Plant Total RNA Isolation Kit の初期最大量は、操作サンプルの 1 回の精製あたり 50 mg です。ポリフェノール多糖類の植物サンプルについては、Plant Total RNA Isolation Kit Plus をお試しいただくことをお勧めします。

4. 遠心分離機の温度が低すぎます。

全 RNA の単離と精製は、サンプル組織の液体窒素による破壊を除き、すべてのステップを室温 (20 ～ 25 °C) で実行します。一部の低温遠心分離機の温度は 20 °C 未満であり、DNA クリーニング カラムや RNA のみのカラムで詰まりが発生する可能性があります。このような場合は、遠心分離機の温度を 20 ～ 25 °C に設定し、溶解混合物および/またはエタノール分離上清の添加を 37 °C に予熱してください。

RNA が抽出されないか、RNA 収量が低い

通常、回収効率に影響を与える要因は数多くあります。たとえば、サンプル RNA の含有量、操作方法、溶出量などです。

一般的な原因を以下のように分析します。

1.操作中に氷浴または低温（4℃）遠心分離を行った。

提案: 全プロセスを室温 (15 ～ 25°C) で操作し、氷浴や低温遠心分離は行わないでください。

       2.サンプルの不適切な保存またはサンプルの長期保存により、RNA が分解されました。

推奨事項: 採取したばかりのサンプルは液体窒素で急速凍結し、-80°C で長期間保存する必要があります。サンプルの凍結と解凍を繰り返すことは避けてください。または、サンプルをすぐに RNA 安定化剤 RNAlater 溶液 (動物サンプル) に浸します。

       3.サンプルの断片化と溶解が不十分であると、精製カラムの閉塞につながります。

提案: 組織を粉砕するときは、組織が十分に粉砕されていることを確認し、事前に調製したバッファー PSL1 にすばやく移してください (正しい割合の β-ME が添加されていることを確認してください。手順のステップ 1 を参照してください)。

4.溶離液の添加が間違っています。

提案: RNase フリーの ddH であることを確認してください。₂精製カラム膜の中央にOを滴下します。

5.正しい量の無水エタノールがバッファー PSL2 またはバッファー PRW2 に添加されませんでした。

提案: キットを使用する前に、指示に従い、適切な量の無水エタノールをバッファー PSL2 およびバッファー PRW2 に加え、よく混合してください。

6.組織サンプルの量が不適切です。

提案: 500 μl のバッファー PSL1 あたり 50 mg の組織を使用します。組織の使用量が多すぎると、抽出される RNA の量が減少し、得られる RNA の純度も低下します。初回サンプル投与量は RNA 抽出操作あたり 50 mg を超えないようにすることを強くお勧めします。

7. 不適切な溶出量または不完全な溶出。

提案: 精製カラムの溶離液量は 50 ～ 200 μl です。溶出効果が満足できない場合は、予熱した RNase-Free ddH を加えた後、室温での時間を延長することをお勧めします。₂O、5〜10分など。

8.バッファー PRW2 で洗浄した後、精製カラムにはエタノール残留物が残っています。

   提案: 空のチューブを 1 分間遠心分離し、バッファー PRW2 で洗浄した後にまだエタノールが残っている場合は、空のチューブの遠心時間を 2 分間に増やすか、精製カラムを室温に 5 分間置いて残留エタノールを完全に除去します。

9.キットの使用方法が間違っていた。

   提案: ポリフェノール多糖類の植物サンプルの場合、Plant Total RNA Isolation Kit などの一般的なキットを使用すると、理想的な RNA サンプルを取得できない可能性があります。ポリフェノール多糖類植物サンプル用に特別に設計された Plant Total RNA IsolationKit Plus の使用をお勧めします。ポリフェノールおよび多糖類の植物サンプルから RNA を抽出するために特別に開発されたキットです。

OD260/OD280の値が低い

ddHによるRNA溶出₂O を分光光度計の読み取りに使用すると、OD260/OD280 値が低くなります。RNase-Free ddH ではなく、10 mM Tris-HCl、pH 7.5 の使用をお勧めします。₂O で RNA を溶出)、比較的正確な OD260/OD280 値を取得するには、19 ページの「RNA 濃度および精製アッセイ」を参照してください。

精製されたRNAは分解される

精製された RNA の品質は、サンプルの保存、RNase の汚染、操作などの要因に関連します。

一般的な原因の分析:

1.組織サンプルが採取後に期限内に保管されなかった。

    推奨: 組織サンプルを採取後、期限内に使用しない場合は、直ちに液体窒素中で低温で保存するか、液体窒素で急速凍結した後、長期保存する場合は -80°C に移すか、サンプルをすぐに RNA 安定化剤 RNAlater 溶液 (動物サンプル) に浸してください。RNA 抽出には、新しく採取した組織サンプルを使用するようにしてください。

2.組織サンプルの凍結と融解の繰り返し。

   提案: 組織サンプルを保存する場合、サンプルの凍結と融解の繰り返しによる RNA の劣化を避けるために、組織サンプルを保存用に小さく切り、使用するときに一部を取り出すのが最善です。

3.手術室にRNaseが導入されているか、使い捨ての手袋やマスクなどを着用していない。

   提案: RNA 抽出実験は RNA 操作を別々に行うのが最善であり、RNase の導入による RNA の分解を最大限に避けるために、実験台は実験前に清掃し、実験中は使い捨ての手袋とマスクを着用する必要があります。

4.試薬は使用中にRNaseにより汚染されます。

   提案: 関連実験用の新しいシリーズの植物トータル RNA 抽出キットと交換してください。

5.RNA操作に使用する遠心管やピペットチップはRNaseで汚染されています。

提案: RNA 抽出に使用する遠心管、ピペットチップ、ピペットなどがすべて RNase フリーであることを確認してください。

取扱説明書:

植物トータル RNA 分離キット取扱説明書