1. RNA溶液の吸光度を検出する
280nm、320nm、230nm、260nmの吸光度はそれぞれ核酸、バックグラウンド（溶液の濁度）、塩濃度、タンパク質などの有機物の値を表します。通常は OD260/OD280 (比率、R) のみを確認します。1.8～2.0であれば、RNA中のタンパク質やその他の有機物の混入は許容できると考えられますが、吸光度を検出するための緩衝液としてTrisを使用した場合、R値が2を超える可能性があることに注意してください（通常は<2.2のはずです）。R<1.8 の場合、溶液中のタンパク質またはその他の有機物の汚染がより明白になり、必要に応じて RNA の運命を決定できます。R>2.2の場合、RNAが単一の核酸に加水分解されたことを意味します。
2.RNAの電気泳動パターン
一般にRNAの電気泳動には変性ゲルが使用されますが、RNAの品質を検出するだけであれば変性ゲルは必要なく、通常のアガロースゲルを使用できます。電気泳動の目的は、28S バンドと 18S バンドの完全性とその比率、または mRNA スメアの完全性を検出することです。一般に、28S および 18S バンドが明るく、鮮明で鮮明で (バンドのエッジが鮮明であることを指します)、28S の明るさが 18S バンドの 2 倍以上であれば、RNA の品質は良好であると考えられます。
上記の 2 つの方法は私たちがよく使用する方法ですが、どちらの方法も RNA 溶液中に RNase が残留しているかどうかを明確に知ることはできません。溶液中に微量の RNase が存在する場合、上記の方法で検出することは困難ですが、その後の酵素反応のほとんどは 37 度以上で長時間行われます。このように、RNA 溶液中に RNase が非常に少量であれば、その後の実験でそれらの役割を果たすのに非常に適した環境と時間が存在し、もちろんこの時点では実験はコールドになります。RNA溶液中にRNaseが残留しているかどうかを確認する方法を紹介します。
3. 保温試験
サンプル濃度に応じて、RNA 溶液から 1000 ng RNA を 2 つ取り出し、0.5 ml 遠沈管に加え、pH 7.0 のトリス緩衝液を加えて総量 10 μl とし、チューブのキャップを閉めます。そのうちの1つを70℃の恒温水槽に入れ、1時間保温します。残りの部分は-20℃の冷蔵庫に1時間保管しました。時間が経過したら、電気泳動のために 2 つのサンプルを取り出します。電気泳動が完了したら、2 つの電気泳動バンドを比較します。2 つのバンドが一致しているか、有意な差がない場合 (もちろん、方法 2 の条件も満たしています)、RNA 溶液中に RNase の汚染が残存しておらず、RNA の品質が非常に良好であることを意味します。逆に、70℃でインキュベートしたサンプルが明らかな分解を示した場合は、RNA 溶液に RNase 汚染があることを示します。
2 RNA抽出のための実験方法と技術
RNA を抽出するときによく遭遇する問題は次のとおりです。(1) RNA 収量が低い。(2) RNA には深刻な塩害がある。(3) RNA には深刻な有機溶媒汚染があります。(4) サンプルの劣化等の問題
1. 一般的に使用されるtotal RNA抽出試薬
動物組織や動物細胞からのトータル RNA の抽出には、グアニジン イソチオシアネート法とトリゾール法が最も一般的に使用されています。ウサギの皮膚や動物の結合組織からのトータル RNA の抽出など、抽出が特に困難な少量のサンプルや組織に特に適しています。さらに、Trizol は汎用溶解試薬として、植物組織、細菌、真菌、その他の組織の抽出にも使用できます。ツバキ、茶葉、菜種などの多糖類やポリフェノールを含む植物組織の場合、CTAB 法を使用してトータル RNA を抽出することもできます。
従来法と同様に、ダブルカラム法も常温操作でRNaseの添加が不要で、抽出にクロロホルムやフェノールなどの有機試薬を使用しない安全性から大変人気があります。(おすすめ商品 )
2. 動物組織からのトータルRNAの抽出
(1) 新鮮でない場合は、新鮮な組織を選択するようにしてください（できれば3か月以内-80℃の冷蔵庫または液体窒素で凍結してください。組織を切断するときは、室温で直接切断せず、必ずアイスボックスの上に置き、凍結と解凍を繰り返さないようにしてください。）
(2) 清潔なハサミとピンセットを使用して小さな組織片を切断します。サンプルを切断するときに組織の中央部分を切断するようにするか、最初に大きな組織片を中央から切断し、次に新しい切開位置でサンプルを切断します。除去した組織を完全に細断し、RNase を含まない EP チューブに細断した組織を入れ、ライセートを加え、細断した組織を完全にライセートにさらし、均質化の準備をします。
(3) 正常組織の場合、均質化のために緑豆サイズの組織 (30 ～ 60 mg) を選択します。組織に多量のタンパク質、脂肪、または肝臓などの緻密な繊維組織が含まれる場合は、切断組織の量を適切に増減します（オプション）。10 ～ 20 mg を選択します）。
(4) 魚の筋肉、エビ肉、クラゲなど水分を多く含む組織を抽出する場合は、サンプル量を適切に増やす必要があります (100 ～ 200 mg を推奨)。
(5) 条件が許せば、高通過組織ホモジナイザーでホモジナイズした後、動物組織を直接抽出することもできます (そのような装置がない場合)。
(6) 最終抽出後に得られた RNA は、RNA の分解を減らすために直ちにアイスボックス上に置く必要があります。
3. 動物細胞RNA抽出
(1) 懸濁細胞: 直接遠心して培地を捨て、滅菌 PBS で 1 ～ 2 回洗浄し、適量の PBS で懸濁し、ライセートを加えて溶解します。液体を完全に捨てた後、沈殿した細胞にライセートを直接添加しないでください。これにより、外層の溶解細胞の後に放出されるヒストンパッケージが沈殿細胞の外側に付着し、それによってペレット内の細胞と溶解物との接触が制限されます。その結果、細胞溶解が不完全になり、RNA 収量が減少します。
(2) 半接着または接着が弱い細胞：培地を捨てた後、PBS で 1 ～ 2 回洗浄し、適量の PBS を直接吸収させ、ピペットまたはガンで培養皿を吹き飛ばして細胞を吹き飛ばし、RNA フリーの細胞に移します。抽出のために酵素の EP チューブにライセートを追加します。
(3) 接着細胞: 最初にトリプシンで消化する必要があります。次に、RNase フリーの EP チューブに収集し、遠心分離して上清を除去し、PBS で 1 ～ 2 回洗浄して過剰なトリプシンを除去し、適量の PBS で再懸濁します。その後、抽出ステップに進みます。
4. 植物RNA抽出
植物組織は、フェノール化合物や多糖類が豊富であるか、未確認の二次代謝産物が含まれているか、または RNase の活性が高いです。これらの物質は細胞溶解後に RNA と緊密に結合して不溶性複合体またはコロイド状沈殿を形成しますが、これらは除去が困難です。したがって、植物組織を抽出する場合には、植物用のキットを選択する必要があります。キット内のライセートは、ポリフェノールの容易な酸化と多糖類化合物と核酸の分離の問題を効果的に解決できます。
（多糖類ポリフェノール植物RNA抽出の推奨品：
(1)植物の皮、果肉、種子、葉等を乳鉢で十分に粉砕する。粉砕プロセス中は、サンプルの溶解を避けるために液体窒素を適時に補充する必要があります。RNA の分解を避けるために、粉砕したサンプルをすぐにライセートに加えて振盪する必要があります。
(2) 米や小麦の葉などの繊維が豊富なサンプルの場合は、抽出量を適切に減らす必要があります。そうしないと、組織の粉砕と溶解が完了せず、抽出される RNA の収量が低くなります。
(3) ザクロ果実、スイカ果実、モモ果実などの水分含有量の高い植物組織の場合は、サンプル サイズを適切に増やす必要があります (100 ～ 200 mg はオプションです)。
(4) 植物の葉、根茎、硬い果実などの植物組織は、通常、液体窒素を用いて乳鉢で成分を十分にすりつぶしてから抽出工程に進むことが推奨されます。従来の組織ホモジナイザーは植物組織の均質化に効果がない可能性があり、一般的に推奨されません。
5. RNA抽出時の注意点
(1) 組織サンプルは、凍結と融解の繰り返しを避けるために、できるだけ新鮮なものである必要があります。
(2) 組織は抽出時に十分に粉砕され、組織の量は多すぎても少なすぎてもいけません。
(3) サンプルを完全に溶解するために、ライセートを添加した後、十分なインキュベーション時間を与える必要があります。
(4) Trizol 法を使用して抽出する場合、重層後の上清を吸収する原則は「多く吸入するよりも少なく吸入することを優先する」であり、中間層まで抽出してはなりません。そうしないと、深刻なゲノム DNA 汚染が発生します。
(5) 洗浄の際は、洗浄液が管壁の周囲に十分に浸透するようにして、十分に洗浄してください。
(6) カラム抽出法では、洗浄後にカラムを取り外すほか、吸着カラムをウルトラクリーンベンチに設置し、5～10分間ブローして有機溶媒を十分に蒸発乾固させます。
(7) カラム法の最後の溶出では、DEPC 水を加えた後、3 ～ 5 分間インキュベートするか、溶出収率を高めるために DEPC 水を事前に 60℃に加熱する必要があります。従来のトリゾール切断およびイソプロパノール沈殿法では、最終的な RNA を DEPC 水に溶解するため、溶解に適切な時間を与え、ピペットチップで遠沈管の底を吹き続ける必要があります。
3Three RNA 濃度が低い/品質が悪い場合の原因と解決策
1. 収量が低すぎる
抽出サンプルが少なすぎるか、総量が不十分であるか、抽出サンプルが多すぎて溶解が完了していません。適切な品質の組織または細胞を抽出に使用する必要があり、サンプルの前処理を十分に行う必要があり、溶解が十分である必要があります。
2. ゲノム残基
Trizol法で抽出する場合、重層後に上清が中層に吸い込まれると深刻なゲノム汚染が発生します。レイヤリングするときは、中間層に吸い込まれないように特に注意してください。カラム法で抽出する場合は、DNase Iを含むキットを選択して抽出することができます。メンブレンに吸着された核酸は DNase I で直接消化され、DNA 残基を大幅に削減できます。
3. RNA分解
それは、抽出されたサンプル自体の劣化、または抽出プロセス中に引き起こされる劣化である可能性があります。RNA抽出にはできる限り新鮮なサンプルを使用し、採取したサンプルは適時に液体窒素または-80℃の冷蔵庫に保管し、凍結と融解を繰り返すことは避けてください。RNA 抽出プロセスでは、RNase/DNase フリーのチップ、遠心分離管、その他の材料を使用する必要があります。抽出プロセスはできるだけ速く行う必要があります。抽出した RNA はアイスボックスに置き、-80 度で保存する必要があります。抽出したRNAをゲル電気泳動で検出する必要がある場合は、抽出後直ちに電気泳動を行い、泳動バッファーを新たに調製したものに交換してください。
4. 塩分および有機溶剤の残留
抽出試薬にはフェノール塩とグアニジン塩が含まれており、洗浄液にはエタノールが含まれています。抽出プロセス中に、ライセートが完全に吸収されずに廃棄されず、洗浄溶液が完全に乾燥しませんでした。残留した塩と有機溶媒は、その後の逆転写や PCR に有害です。阻害の程度は異なるため、抽出プロセス中に組織溶解物を完全に除去する必要があり、チューブの周囲の壁を洗浄できるように洗浄が十分である必要があります。さらに、チューブを空にして吹き飛ばすことは必要なステップであり、有機物の残留物をさらに減らすことができます。
RNA 抽出の詳細については、当社の Web サイトをご覧ください。
詳細については、www.foreivd.com をご覧ください。
投稿日時: 2022 年 12 月 1 日
