私たちは経験豊富なメーカーです。中国の高感度ワンステッププローブ Rt の大幅割引市場における重要な認証で過半数を獲得QPCRキット V2、品質は工場の命です。顧客の要求に焦点を当てることが会社の存続と発展の源です。私たちは誠実さと誠実な労働態度を堅持し、あなたのお越しを楽しみにしています。
私たちは経験豊富なメーカーです。市場の重要な認証で過半数を獲得中国 Taq DNA ポリメラーゼ, QPCR、当社は、リーズナブルな価格、短い生産時間、満足のいくアフターサービスを約束します。いつでも工場を訪問することを歓迎します。私たちが一緒に楽しく長期的なビジネスを続けられることを願っています!!!

説明

このキットは、RT-qPCR 反応用に培養細胞サンプルから RNA を迅速に放出できる独自の溶解バッファー システムを使用しており、時間と労力のかかる RNA 精製プロセスを排除します。RNA テンプレートはわずか 7 分で取得できます。キットに含まれる 5x Direct RT Mix および 2x Direct qPCR Mix-SYBR 試薬は、迅速かつ効果的にリアルタイムの定量的 PCR 結果を得ることができます。

5x Direct RT Mix および 2x Direct qPCR Mix-SYBR は強力な阻害剤耐性を備えており、サンプルのライセートを RT-qPCR のテンプレートとして直接使用できます。このキットには、独自の RNA 高親和性 Foregene 逆転写酵素、Hot D-Taq DNA ポリメラーゼ、dNTP、MgCl が含まれています。₂、反応バッファー、PCR オプティマイザーおよびスタビライザー。

仕様

200×20μl Rxns、1000×20μl Rxns

キットのコンポーネント

特徴と利点

■ シンプルかつ効果的 : Cell Direct RT テクノロジーを使用すると、RNA サンプルをわずか 7 分で取得できます。

■ サンプル需要は少なく、10 セル程度でテストできます。

■ ハイスループット: 384、96、24、12、6 ウェルプレートで培養された細胞内の RNA を迅速に検出できます。

■ DNA Eraser は、放出されたゲノムを迅速に削除し、その後の実験結果への影響を大幅に軽減します。

■ 最適化された RT および qPCR システムにより、2 ステップの RT-PCR 逆転写がより効率的になり、PCR の特異性が高まり、RT-qPCR 反応阻害剤に対する耐性が高まります。

キットの適用

適用範囲：培養細胞。

- サンプル溶解によって放出された RNA: このキットの RT-qPCR テンプレートにのみ適用されます。

・本キットは、遺伝子発現解析、siRNAによる遺伝子サイレンシング効果の検証、薬剤スクリーニングなどの目的で使用できます。

ダイアグラム

保管と賞味期限

このキットのパート I は 4℃ で保管してください。パート II は -20℃ で保管してください。

Foregene Protease Plus II は 4℃ で保存し、-20℃ で凍結させないでください。

試薬 2×Direct qPCR Mix-SYBR は暗所で -20℃ で保存してください。頻繁に使用する場合は、4℃での短期保存（10日以内に使い切る）も可能です。当社は経験豊富なメーカーです。中国高感度ワンステッププローブ Rt-Qpcr キット V2 の市場の重要な認証で過半数を獲得し、品質は工場の命です。顧客の需要に焦点を当てることが会社の存続と発展の源です。私たちは誠実さと誠実な勤務態度を堅持し、あなたのお越しを楽しみにしています。
大幅な割引中国 Taq DNA ポリメラーゼ、Qpcr、当社は、リーズナブルな価格、短い生産時間、満足のいくアフターサービスを約束します。いつでも工場を訪問することを歓迎します。私たちが一緒に楽しく長期的なビジネスを続けられることを願っています!!!

QuickEアッシーTM Cell Direct RT-qPCR Kit -タクムan

カタログ番号 DRT-01021/01022

1000,000 個以下の細胞を使用するセルダイレクト RT-qPCR の場合

製品導入

この製品は、独自の溶解バッファー システムを使用して、RT-qPCR 反応用の培養細胞サンプルから RNA を迅速に放出します。これにより、時間と手間のかかる RNA 精製プロセスが不要になり、必要な RNA テンプレートを取得するのにわずか 7 分で済みます。キットによって提供される 5x Direct RT Mix、2x Direct qPCR Mix-Taqman を使用すると、迅速かつ効率的にリアルタイム定量 PCR 結果を得ることができます。

5x Direct RT Mix および 2x Direct qPCR Mix-Taqman は、強力な阻害剤耐性を備えており、測定対象のサンプルのライセートをテンプレートとして使用して効率的な逆転および特異的増幅を実行できます。試薬には、Foregene 逆転写酵素、Hot D-Taq DNA ポリメラーゼ、dNTP、MgCl が含まれています。₂、反応バッファー、PCR オプティマイザー、スタビライザーは、溶解バッファーと併用してサンプルを迅速かつ簡単に検出でき、高い感度、特異性、安定性の特性を備えています。

製品の特徴

シンプルで効果的な Cell Direct RT テクノロジーにより、RNA サンプルの取得にわずか 7 分かかります。

必要なサンプルは少なく、最低 10 個の培養細胞を実験に使用できます。

384、96、24、12、6 ウェル プレートなどの培養細胞の迅速な RNA 取得のためのハイスループット。

DNA Eraser は、放出されたゲノムを迅速に削除することができ、その後の実験結果への影響を大幅に軽減します。

最適化された RT および qPCR システムにより、より効率的な逆転写、特異性、および強力な RT-qPCR 反応阻害剤耐性を備えた 2 ステップ RT-PCR が可能になります。

キットの適用

適用範囲: 培養細胞。

サンプル溶解解釈 RNA: 2 ステップ RT-qPCR テンプレートとしてのみ使用されます。

キットは、遺伝子制御発現解析、対立遺伝子検査、薬物スクリーニングなどの目的に使用できます。

キットの制限事項

増幅されたフラグメント ≤ 300 bp。

キットは細胞を新たに培養するために使用されます。

製品の品質管理

FOREGENE の総合品質管理システムによると、Cell Direct RT-qPCR シリーズ キットの各バッチは、キットの各バッチの品質の信頼性と安定性を確保するために複数回厳密にテストされています。

キット内容

*:Cell Lysis、5x Direct RT Mix、2x Direct qPCR Mix-Taqman は個別に購入できます。詳細は付録 1 (13 ページ) に記載されています。

保管条件

1. 配送条件

キットが 4 °C 未満の状態にあることを確認するための、低温アイスパックボックス輸送の全プロセス。

2. 保管条件

パート I は 4°C、パート II は -20°C で保管してください。

Foregene Protease Plus II は、-20°C で冷凍せず、4°C で保管してください。

試薬 2x Direct qPCR Mix-Taqman は、-20°C で保管されます。頻繁に使用する場合 (10 日以内)、短期間の使用の場合は 4°C で保管されます。

キットのコンポーネント情報

Buffer CL: 細胞溶解反応に必要な環境を提供します。

Buffer ST: ライセート中の活性物質を停止させ、その後の RT への影響を回避します。

DNA イレイサー: DNA 除去剤、その後の実験におけるゲノムの除去の効果。

5x ダイレクト RT ミックス: 最適なアラインメントのための高 RNA 親和性 Foregene 逆転写酵素、RNase インヒビター、dNTP、スタビライザー、エンハンサー、オプティマイザー、および逆転写プライマー (ランダム プライマー、オリゴ (dT)) が含まれています。₁₈プライマー）。

Foregene Protease Plus II: 溶解バッファーを使用すると、細胞が溶解されて核酸が放出されます。

2× Direct qPCR Mix-Taqman: この試薬には Hot D-Taq DNA ポリメラーゼ、dNTP、MgCl が含まれています₂、反応バッファー、PCR オプティマイザー、スタビライザー。

20× ROX Reference Dye: ABI、Stratagene などのリアルタイム PCR 増幅装置で一般的に使用され、PCR 投与エラーによって引き起こされる PCR チューブとチューブ間の差異を調整するために使用されます。機器ごとに必要な 20× ROX Reference Dye 濃度は異なりますが、ユーザーは機器の推奨濃度に応じて追加できます。

RNase フリー ddH₂O: 2 ステップ RT-qPCR 反応用の RNase フリーの滅菌超純水。

予防：（キットをご使用になる前に必ず注意事項をよくお読みください）

サンプル間の相互汚染を避けるために、実験の操作方法に注意してください。

RNase の汚染や RNA の分解を避けるために、実験環境と器具の清潔さに注意してください。

新鮮な細胞サンプルまたはよく保存された細胞サンプルを採取し、凍結融解を繰り返した細胞サンプルを決して使用しないでください。

5× ダイレクト qPCR ミックス、2× ダイレクト qPCR ミックス - Taqman では、凍結融解を繰り返すことは避けてください。そうしないと、逆転写と PCR 効率に影響します。

プレパ配給前手術

このキットを使用する前に、必ず説明書をよくお読みください。Cell Direct RT-qPCR キットは、シンプル、便利、迅速に操作でき、説明書にはキット全体とその正しい使用方法に関する完全な情報が記載されています。ご使用前に必要な実験材料・器具をご用意ください。

実験材料および実験器具

◆細胞を培養します。

◆ 1.5 ml または 2 ml、RNase-/DNase-Free 遠心チューブ、RNase-/DNase-Free チップ、0.2 ml 滅菌 qPCR チューブ。

◆qPCR装置、ピペット、卓上遠心機（≥13,400×g) (実験のニーズに応じて) など。

安全性

◆本製品は科学研究のみを目的としており、医薬品、臨床、食品、化粧品などの目的には使用しないでください。

◆薬品を使用する場合は、適切な実験着、手袋、保護メガネ等を着用してください。

手術ガイド

Cell Lysis システム、RT システム、および qPCR 反応溶液サプリメント パックは個別に購入できます。詳細については、付録 1 (ページ 13) を参照してください。

操作ガイド

A: サンプル RNA のリリース

1.細胞を前処理しました:細胞培養プレートを冷PBSで洗浄し、細胞を溶解します(10-10⁶)、10⁶ 細胞の量よりも、RNA の抽出と精製には Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) または Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) をお勧めします。

1.1.接着細胞 (例として 24 ウェルプレート)

1.1.1.各ウェル内の細胞の数を決定し、細胞の数が 1 × 10 であることを決定します。⁵、ピペットを使用して培養皿から培地を除去します。

1.1.2.あらかじめ冷却しておいた 1 × PBS 200 μl を各ウェルに加えます。ピペッティングを繰り返したり、ウェルから PBS を除去したりしないでください。プレートを傾けて、できるだけ多くの PBS を除去します。ステップ2に進みます。

1.1.3.別の細胞培養皿または参照番号表1-1の細胞培養皿に、細胞洗浄のために予冷した1×PBSを加えました。

表 1-1: さまざまな細胞数に対する PBS 投与量

ノート：細胞をしっかりと接着させるために、洗浄時に大量の細胞の損失が回避されます。

1.2.非多孔性プレートで培養された浮遊細胞または付着細胞

1.2.1.非マルチウェルプレートで培養した付着細胞 (浮遊細胞は次のステップ 1.2.2 から開始します)、通常の細胞収集方法に従って細胞を収集および分離し、培養プレートまたは遠心分離管に置きます。トリプシン処理を使用する場合は、遠心分離して細胞を収集し、残留トリプシンを除去する必要があります。PBS を加えて細胞を個々の細胞に再懸濁して細胞を分散させます。

1.2.2.細胞数を数えた後、細胞を 1×10 個に分注します。⁵ 1 つは遠心分離チューブに移し、1000 × g で 10 分間遠心分離して細胞を収集します。

1.2.3.200μlのPBSを遠心管に加え、繰り返しピペッティングせず、PBSを直接吸引します。ステップ 2 に進みます。 (沈殿するのが難しく、細胞が再度懸濁された場合は、上清を捨てた後 10 分間 1000 xg で遠心分離し、細胞ペレットをステップ 2 に進めます)

2. 細胞溶解: 以下の表 1-2 の調製済み溶解システムに従って、温度を室温に平衡化した Buffer CL、DNA Eraser、および Foregene Protease Plus II を取り出します: (溶解溶液はすぐに使用できます)。

表1-2: へき開 システムの準備（注：氷上での準備中）

3. (24 ウェルプレートの例) 細胞溶解マスターミックス 200 μl を各ウェルにピペットで注入し、5 ～ 10 回繰り返し吹き込み、室温 (20 ～ 25 ℃) で 5 分間インキュベートします。

ノート：気泡の発生を避けるため、ピペッティングの際はピペットの目盛りを200μl以下に調整してください。溶解後、細胞が曇って見えることがありますが、これは正常です。

4. (例として 24 ウェルプレート) 液体 20 μl の Buffer ST (異なる溶解システム Buffer ST を表 1-3 に示す量で添加) を加え、ピペッティングを 5 ～ 10 回繰り返し、室温 (20 ～ 25 ℃) で 2 分間インキュベートします。

ノート：ピペットチップは表面の下に配置され、ライセートが確実に追加されました、気泡の発生を避けるため、ピペッティングの際はピペットの目盛りを200μl以下に合わせてください。

表1-3：バッファSTの追加

5. ライセートはその後の RT-qPCR 実験に使用されます。その後の実験が間に合わない場合は、氷上で2時間以内、-20℃または-80℃で保管してください（3か月以内）。

B: RT システムの準備

1. 5 × Direct RT Mix を取り出し、氷浴上に置き、自然に溶かし、後で使用するために穏やかに混ぜます。RNase-Free ddH2O を取り出して溶かし、後で使用するために氷浴上に置きます。以下の表 2-1 に従って、氷上で反応系を調製します。

表 2-1: RT 反応系の準備

2.システムの配合が完了したら、穏やかに混合し、以下の表2-​​2の反応条件で短時間遠心分離します。RT反応。

表 2-2: RT 反応条件の設定

3.反応終了後、反応生成物を直接氷上に置き、qPCRを行います。-20℃または-80℃で長期保存してください。

注: 非精製テンプレートを使用しているため、逆転写産物に白い沈殿物が現れる場合があります。これは正常な現象です。後続の実験のために上清を直ちに遠心分離します。

得られた RT 反応溶液を次のステップのリアルタイム PCR 反応系に添加します。添加量は反応系の 10 ～ 30% の範囲であることが推奨されます。

C：qPCR反応系の準備

1.以下の表3-1に従って、ステップcDNAテンプレートに適量のBを準備し、反応系を準備します。

注: cDNA テンプレートの量は、qPCR システムの 10 ～ 30% を占めます。たとえば、20μl qPCR システムでは、2 ～ 6 μl の溶解バッファーを追加しますが、6 μl を超えないようにしてください。

2.qPCR 反応のための最適化された qPCR 条件 (アニーリング温度など) (反応条件は表 3-2 に示されています)。

注: より良い結果を得るには、qPCR 反応に最適化された条件を使用するようにしてください。

表 3-1: PCR 反応系の準備

1*: プライマーの反応性能が悪い場合、プライマー濃度を 50 ～ 900 nM の範囲で調整できます。

注: qPCR システムは、実験のニーズと蛍光サイクラー モデルに応じて調整できます。50 の qPCR の場合μl システムでは、20 の条件に従って試薬の投与量を比例的に調整します。μlシステム。

2*: 蛍光定量サーマルサイクラーに従って、ROX Reference Dye の適切な最終濃度を選択します。一般的な蛍光定量サイクラーに最適な ROX 参照色素濃度を以下の表に示します。

表 3-2: qPCR 反応条件を示します。

注: 最良の qPCR 効果を得るために、グラジエント PCR を使用して、さまざまなテンプレートおよびさまざまなプライマーの反応条件を最適化できます。PCR の反応条件は、蛍光分析装置、テンプレート、プライマーなどによって異なります。具体的な操作では、蛍光定量サーマルサイクラーの条件、テンプレートの種類、対象断片のサイズ、増幅断片の塩基配列や GC 含有量、プライマーの長さ、アニーリング温度、反応時間などに応じて、最適な反応条件を設計する必要があります。

リアルタイム PCR プライマーの設計原則

フォワードプライマーとリバースプライマー

リアルタイム PCR では、プライマーの設計が非常に重要です。プライマーは PCR 増幅の特異性と効率に関係しており、次の原則を参照して設計できます。

◆プライマー長：18-30bp。

◆GC含有量：40〜60％。

◆ Tm 値: Primer 5 などのプライマー設計ソフトウェアにより、プライマーの Tm 値を得ることができます。上流プライマーと下流プライマーの Tm 値は可能な限り近い必要があります。Tm の計算式、Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T) も使用できます。PCR を実行する場合、一般にプライマー Tm 値の 5 °C より低い温度がアニーリング温度として選択されます (対応するアニーリング温度の上昇により、PCR 反応の特異性が高まる可能性があります)。

◆ プライマーと PCR 産物:

◆プライマーの設計 PCR増幅産物の長さは100～150bpが好ましい。

◆ テンプレートの二次構造領域へのデザインプライマーの使用は可能な限り避けてください。

◆ 上流プライマーと下流プライマーの 3' 末端間に 2 つ以上の相補的な塩基が形成されないようにしてください。

◆ プライマー 3' 末端塩基は、G または C が 3 つ連続して存在することはできません。

◆ プライマー自体が相補的な構造を持つことができず、相補的な構造を持たないとヘアピン構造が形成され、PCR 増幅に影響を及ぼします。

◆ ATCG はプライマー配列中にできるだけ均一に配置し、3' 末端塩基は T として避ける必要があります。

付録1：CエルダイレクトRT-qPCR キットの構成品tサプリメントパック

1.細胞溶解液