RT-qPCR 実験には、RNA 抽出と品質評価、逆転写、qPCR の 3 つのステップが含まれており、各ステップには多くの注意事項があります。以下で詳しく紹介します。

Ⅰ．RNAの品質評価

RT-qPCR実験では、RNA抽出完了後にRNAの品質を評価する必要があり、適格性を確認した場合のみ追跡実験を行うことができます。評価方法には分光光度計、Agilent ゲル電気泳動、Agilent 2100 分析などがありますが、その中でも最も一般的に使用されるのは分光光度計とアガロースゲル電気泳動法の検出です。RNA の品質を保証するために、RNA の濃度、純度、完全性の検出と分析を完了するには、これら 2 つの方法を併用する必要があることに注意してください。

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分光光度計:

分光光度計は主に RNA の濃度と純度を測定するために使用されますが、RNA とゲノム残基の完全性を検出することはできません。このうち、A260/280 と A260/230 は RNA 純度検出にとって重要なパラメーターであり、その値の変動に従って RNA 純度を検出できます。

1. 1.9 < A260/280 < 2.1。RNA 純度が良好であることを示します。A260/280<1.9 は、RNA にタンパク質残基が存在する可能性があることを示しています。A260/280 > 2.1 は、RNA が部分的に分解されている可能性を示しており、これはアガロースゲル電気泳動によってさらに確認できます。

2. 2.0 < A260/230 < 2.2。RNA 純度が良好であることを示します。A260/230< 2.0 は、フェノール、エタノール、糖などの有機試薬の残基が RNA に存在する可能性があることを示しています。

アガロースゲル電気泳動:

アガロースゲル電気泳動アッセイは、RNA の完全性、ゲノム、タンパク質残基を分析できますが、RNA の濃度を正確に定量したり、有機試薬の残基を検出したりすることはできません。真核生物の RNA テンプレートを例に挙げます。

1. RNA をアガロースゲル電気泳動に供しました。ゲルマップ上に 28sRNA、18sRNA、および 5.8sRNA の単一バンドが 3 つだけ存在する場合、抽出された RNA が無傷であることを示します。引きずり現象がある場合、それは RNA の部分的な分解を示します。

2. 接着剤の穴と 28sRNA バンドの間に単一の明るいバンドがある場合は、ゲノム DNA 残基が存在する可能性があります。

3. 接着剤の穴にバンドが現れる場合は、タンパク質やその他の高分子物質が残留している可能性があることを示しています。

Ⅱ. 逆転写

RNA 抽出が完了したら、次の実験のために cDNA に戻す必要があるため、この反転ステップは不可欠です。逆転写は、逆転写酵素とプライマーの選択から導入されます。

逆転写酵素の選択:

代表的な逆転写酵素には、AMV RTase と MMLV RTase があります。AMV RTaseのRNase Hは活性が強く、合成長が短く、合成量が少なく、熱安定性（42～55℃）が良好です。MMLV RTaseのRNase H活性は弱く、合成長は長く、合成量は多く、熱安定性は悪い（37～42℃）。

RNase H 酵素には RNA テンプレートを分解する機能があるため、逆転写時には RNase H 活性の弱い MMLV が優先的に選択される必要があり、その後の遺伝子工学の進歩により、MMLV の熱安定性は質的に飛躍的に向上しました。フォアジーンの取り組みForeasy Reverse Transcriptase (逆転写用 M-MLV) 一例として、遺伝子組換え技術を使用して大腸菌で遺伝子操作された細菌で発現される新しい逆転写酵素です。これは、一本鎖 RNA、DNA、または RNA:DNA ハイブリッドから相補的な DNA 鎖を合成する組換え DNA ポリメラーゼです。RNase H 活性がなく、安定性が高く、RNA 親和性が高く、検出感度が高いです。

 

Foreasy Reverse Transcriptase (逆転写用 M-MLV)

プライマーの選択:

一般に、RT プライマーは、オリゴ dT、ランダム プライマー、および遺伝子特異的プライマーの 3 つのカテゴリに分類されます。さまざまな実験要件に応じて、使用する適切なプライマーを選択します。

1. テンプレートが真核生物由来で、後期 cDNA がルーチンの PCR 増幅に使用される場合は、オリゴ (dT) が推奨されます。その後の実験が qPCR のみに使用される場合は、逆転写の効率を向上させるために、オリゴ (dT) をランダム プライマーと混合することをお勧めします。

2. テンプレートが原核生物由来の場合、逆転写にはランダム プライマーまたは遺伝子特異的プライマーを選択する必要があります。

Ⅲ。qPCR

蛍光定量は主に定量法の選択、プライマーの設計原理、ROXの選択、反応系の構成と反応条件の設定などから精緻に行われます。

定量的手法の選択:

定量法は相対定量法と絶対定量法に分けられます。相対定量は、遺伝子発現に対する特定の治療法の効果を検出したり、異なる時点での遺伝子発現の差異を検出したり、異なる組織での遺伝子発現の差異を比較したりするために使用できます。絶対定量ではウイルスなどの核酸量を検出できます。実験を行うときは、自分自身の実験に応じて適切な定量的方法を選択する必要があります。

プライマー設計の原則:

qPCR 用のプライマーの設計は、増幅効率と産物の特異性に直接関係します。したがって、適切なプライマーを正しく設計することが、qPCR を成功させる第一歩となります。プライマーの設計では、従来のプライマー設計の原則を満たすために、次の原則に注意を払う必要があります。

1. ターゲットフラグメントの長さは 100 ～ 300 bp の間で制御されます。

2. ゲノムDNAの影響を避けるためのクロスエクソン設計。

3. 設計したプライマーは増幅効率をテストする必要があり、増幅効率が標準 (90 ～ 110%) に達した場合にのみ定量実験に使用できます。

4. プライマー濃度は通常、0.1uM ～ 1.0uM の間で最適化されます。

の選択ロックス:

ROX は定量反応のプロセスにおいて、光路差、ピペッティング誤差、蒸発や凝縮によって生じる体積差を均一に調整し、結果の再現性を向上させます。ただし、ROX の選択は機器に関連していることに注意してください。qPCR 装置にホール間の差異を自動補正する機能がある場合、ROX を追加する必要はありません。それ以外の場合は、ROX 補正を追加する必要があります。試薬を購入する小規模パートナーは、後で間違いを避けるために、使用する機器に従って正しい ROX を選択する必要があります。

反応系の準備：

反応量は20μlおよび50μlが好ましい。制度を策定する際には、次の事項に留意する必要があります。

1. 反応システムは、超クリーンな作業台、新しい ddH で換気して準備する必要があります。₂O は各実験に使用されます。

2. 各実験では、システム内に汚染があるかどうかを検証するために NTC を準備する必要があり、システムを準備するときにプライマーのすべてのペアが NTC を実行する必要があります。

3. RNA テンプレートに gDNA 残基があるかどうかを検出するために、検出用サンプルごとに NRT を調製できます。

4. システムを準備するときは、1 つのサンプルに対して少なくとも 3 回の技術的な繰り返しを行うことをお勧めします。

5. 鋳型が cDNA の場合、qPCR 実験における逆転写系の阻害効果を軽減するために 5 ～ 10 倍に希釈することをお勧めします。CT 値が 20 ～ 30 の間に収まるように、勾配によってテンプレートの量を調査することをお勧めします。

6. 必要な反応数を決定し、反応数に基づいて 5 ～ 10% 増加させ、ボリューム構成数を計算します。

7、システムはプレミックス原理を使用して準備され、遠心分離後に混合し、気泡がないことを確認します。

8、サポート消耗品を可能な限り選択します。

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