蛍光定量的PCR（別名TaqMan PCR、以下FQ-PCR）は、1995年に米国のPE社（パーキンエルマー社）が開発した新しい核酸定量技術です。この技術は、従来のPCRに蛍光標識プローブを加えたものです。フレキシブル PCR と比較して、FQ-PCR は定量機能を実現する上で多くの利点があります。この記事では、この技術の特徴、原理、手法、応用について簡単に説明することを目的としています。

1 特徴

FQ-PCRは、通常のPCRに比べて感度が高いだけでなく、蛍光プローブを使用するため、PCR増幅中の蛍光シグナルの変化を光電伝導系で直接検出して定量的な結果を得ることができ、従来のPCRの多くの欠点を克服し、DNAハイブリダイゼーションの高い特異性と分光技術の高精度も兼ね備えています。

例えば、一般的なPCR産物は、アガロースゲル電気泳動と紫外光による臭化エチジウム染色、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動と銀染色によって観察する必要があります。これには複数の機器が必要なだけでなく、時間と労力もかかります。使用される臭化エチジウム染色剤は人体に有害であり、これらの複雑な実験手順により汚染や偽陽性が発生する機会が生じます。しかし、FQ-PCR では、サンプルのロード時に蓋を 1 回開けるだけで済み、その後のプロセスは完全に密閉されたチューブ操作であるため、PCR の後処理は必要なく、従来の PCR 操作の多くの欠点を回避できます。実験には通常、PE 社が開発した ABI7100 PCR サーマルサイクラーが使用されます。

この装置には以下の特徴があります。 ① 幅広い用途: DNA および RNA の PCR 産物の定量化、遺伝子発現研究、病原体の検出、および PCR 条件の最適化に使用できます。② 独自の定量原理：蛍光標識プローブを使用することで、レーザー励起後のPCRサイクルに応じて蛍光量が蓄積され、定量の目的が達成されます。③ 高い作業効率: 内蔵 9600 PCR サーマルサイクラー、コンピューター制御により 1 ～ 2 時間で 96 サンプルの増幅と定量が自動的かつ同期的に完了します。④ ゲル電気泳動不要：サンプルを希釈して電気泳動する必要がなく、特殊なプローブを使用して反応管内で直接検出します。⑤配管内を汚染しない：独自の全密閉型反応管と光電伝導方式を採用しており、配管内を汚染する心配がありません。⑥結果は再現可能です。定量的なダイナミックレンジは最大 5 桁です。したがって、この技術は開発に成功して以来、多くの科学研究者によって評価され、多くの分野で応用されています。

2 原理と手法

FQ-PCR の動作原理は、Taq 酵素の 5'→3' エキソヌクレアーゼ活性を利用して、蛍光標識プローブを PCR 反応系に追加することです。プローブは、プライマー配列に含まれる DNA テンプレートと特異的にハイブリダイズすることができます。プローブの 5' 末端は蛍光発光遺伝子 FAM (6-カルボキシフルオレセイン、蛍光発光ピーク 518nm) で標識され、3' 末端は蛍光消光基 TAMRA (6-カルボキシテトラメチルローダミン、蛍光発光ピーク 582nm) で標識されており、PCR 増幅中のプローブの伸長を防ぐためにプローブの 3' 始まりがリン酸化されています。プローブが無傷のままである場合、消光基は発光基の蛍光発光を抑制します。発光基が消光基から分離されると、阻害が解除され、518nm での光学密度が増加し、蛍光検出システムで検出されます。再生段階では、プローブは鋳型 DNA とハイブリダイズし、伸長段階では Taq 酵素がプライマーの伸長に伴って DNA 鋳型に沿って移動します。プローブが切断されると、消光効果が解除され、蛍光シグナルが放出されます。テンプレートがコピーされるたびに、プローブが切断され、それに伴い蛍光シグナルが放出されます。放出された蛍光色素分子の数と PCR 産物の数の間には 1 対 1 の関係があるため、この技術を使用してテンプレートを正確に定量できます。実験装置にはPE社が開発したABI7100 PCRサーマルサイクラーを使用するのが一般的ですが、他のサーマルサイクラーも使用できます。反応型反応システムABI7700を実験に使用すると、反応終了後、コンピューター解析により定量結果を直接得ることができます。他のサーマルサイクラーを使用する場合は、蛍光検出器を使用して反応チューブ内の蛍光シグナルを測定し、RQ+、RQ-、△RQを計算する必要があります。RQ+はサンプルチューブの蛍光発光グループの発光強度と消光グループの発光強度の比を表し、RQ-はブランクチューブ内の両者の比を表し、△RQ（△RQ=RQ+-RQ-）はPCR中の蛍光シグナル変化量を表します。データ処理後、定量的な結果が得られます。蛍光プローブの導入により、実験の特異性が大幅に向上しました。プローブの設計は、一般に以下の条件を満たす必要があります。 ① 結合の特異性を確保するために、プローブの長さは約 20 ～ 40 塩基である必要があります。②単一塩基配列の重複を避けるため、GC塩基の含有率は40%～60%となります。③ ハイブリダイゼーションやプライマーとの重複を避ける。④ プローブと鋳型の結合の安定性はプライマーと鋳型の結合の安定性よりも高いため、プローブの Tm 値はプライマーの Tm 値より 5℃以上高くなければなりません。さらに、プローブの濃度、プローブとテンプレート配列間の相同性、およびプローブとプライマー間の距離はすべて実験結果に影響を与えます。

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