ニュース - 完全な PCR プライマー設計と PCR の詳細

プライマー設計の基礎（99％の問題は解決できる）

1. プライマーの長さ: 教科書では 15 ～ 30 bp、通常は約 20 bp が必要です。実際の条件では、特異性を確保するには 18 ～ 24 bp が望ましいですが、長ければ長いほど良いため、長すぎるプライマーも特異性を低下させ、収率を低下させます。

2. プライマー増幅範囲: 200 ～ 500 bp が適切で、特定の条件下ではフラグメントを 10 kb まで拡張できます。

3. プライマーベース：G + C の含有量は 40 ～ 60% である必要があります。G + C が少なすぎると増幅効果が悪く、G + C が多すぎると非特異的なバンドが現れやすくなります。ATGC は、5 個を超えるプリンまたはピリミジンヌクレオチドのクラスターを避けて、ランダムに分散するのが最適です。安定性を高めるために 5' 末端および中間配列にマルチ gc を使用し、3' 末端でのリッチ GC を回避し、最後の 3 塩基で GC を行わない、または最後の 5 塩基のうち 3 塩基で GC を行わない。

4. プライマーの二次構造を避け、2 つのプライマー間の相補性、特に 3' 末端での相補性を避けてください。そうしないと、プライマーダイマーが形成され、非特異的な増幅バンドが生成されます。

5. プライマーの 3' 末端の塩基、特に最後と最後から 2 番目の塩基は、対になっていない末端塩基による PCR の失敗を避けるために、厳密に対にする必要があります。

6. プライマーは適切な切断部位を有するか、または適切な切断部位を付加することができ、増幅された標的配列は適切な切断部位を有することが好ましく、これは切断分析または分子クローニングに非常に有益である。

7. プライマーの特異性: プライマーは、核酸配列データベース内の他の配列と明らかな相同性を持ってはいけません。

8. ソフトウェアの使い方を学びます: PP5、Oligo6、DNAstar、Vector NTI、primer3 (このオンラインデザインが最適です)。

上記の内容により、プライマー設計の問題の少なくとも 99% を解決できます。

プライマー設計の詳細を制御

1. プライマーの長さ

一般的なプライマーの長さは18～30塩基です。一般に、プライマーのアニーリング温度を決定する最も重要な要素はプライマーの長さです。プライマーのアニール温度は一般的に（Tm値-5℃）が選択されますが、Tm値をそのまま使用する場合もあります。以下の式を使用して、プライマーのアニーリング温度を大まかに計算できます。

プライマー長が20bp未満の場合：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

プライマー長が20bpを超える場合：62.3℃+0.41℃(%GC)-500/長さ-5℃

さらに、多くのソフトウェアはアニーリング温度の計算にも使用できますが、計算原理が異なるため、計算値にわずかな誤差が生じる場合があります。PCR反応を最適化するために、最高の効率と特異性を得るために54℃以上のアニーリング温度を保証する最短のプライマーが使用されます。

全体として、プライマー特異性はヌクレオチドが追加されるごとに 4 倍増加するため、ほとんどのアプリケーションの最小プライマー長は 18 ヌクレオチドになります。プライマーの長さの上限はあまり重要ではありませんが、主に反応効率に関係します。エントロピーのため、プライマーが長いほど、プライマーがアニールして標的 DNA に結合し、DNA ポリメラーゼが結合するための安定した二本鎖テンプレートを形成する速度が遅くなります。

ソフトウェアを使用してプライマーを設計する場合、プライマーの長さは TM 値によって決まります。特に蛍光定量 PCR のプライマーの場合は、TM=60℃ 程度に管理する必要があります。

2.GCコンテンツ

一般に、プライマー配列中の G+C の含有率は 40% ～ 60% であり、一対のプライマーの GC 含有率と Tm 値を調整する必要があります。プライマーに重大な GC または AT 傾向がある場合、適切な量の A、T、または G および C テールをプライマーの 5' 末端に追加できます。

3. アニール温度

アニーリング温度はアンチェーン温度より5℃低くしてください。プライマー塩基の数が少ない場合は、アニーリング温度を適切に上げることができ、PCR の特異性を高めることができます。塩基の数が多い場合、アニーリング温度を適切に下げることができます。一対のプライマー間のアニーリング温度の差が 4℃ ～ 6℃ であれば PCR 収量には影響しませんが、理想的には一対のプライマーのアニーリング温度は同じであり、55℃ ～ 75℃の間で変化する可能性があります。

4. 増幅テンプレートの二次構造領域を避ける

増幅断片を選択する際には、テンプレートの二次構造領域を避けることが最善です。ターゲットフラグメントの安定な二次構造は、関連するコンピューターソフトウェアによって予測および推定できるため、テンプレートの選択に役立ちます。実験結果によると、拡大する領域の自由エネルギー (ΔG) が 58.6lkJ/mol 未満の場合、拡大は失敗することが多いことがわかります。

5. 標的DNAとの不一致

増幅されたターゲット DNA 配列が大きい場合、プライマーがターゲット DNA の複数の部分に結合し、結果に複数のバンドが現れることがあります。今回は、BLAST ソフトウェアテストの Web サイトを使用する必要があります。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。[2 つのシーケンスを整列させる (bl2seq)] を選択します。

プライマー配列をゾーン 1 に貼り付け、ターゲット DNA 配列をゾーン 2 に貼り付けることは交換可能であり、BLAST は相補鎖、アンチセンス鎖、その他の可能性を計算するため、ユーザーは両方の鎖がセンス鎖であるかどうかを意識する必要はありません。データベース内の配列の GI 番号がわかっている場合は、GI 番号を入力することもできるため、配列の大部分を貼り付ける必要はありません。最後に、「Align at 3」をクリックして、プライマーがターゲット DNA 内に複数の相同部位を持っているかどうかを確認します。

6. プライマー端子

プライマーの 3 ' 末端は伸長が始まる場所であるため、そこから始まるミスマッチを防ぐことが重要です。3 ' 末端は、連続する G または C が 3 個を超えてはなりません。これは、プライマーが G+C 濃縮配列領域で誤ってトリガーされる原因となるためです。特殊な PCR (AS-PCR) 反応を除き、3' 末端は二次構造を形成できません。プライマーの 3' 末端はミスマッチであってはなりません。たとえば、コード領域が増幅される場合、コドンの 3 番目の位置は縮重する傾向があり、増幅の特異性と効率に影響を与えるため、プライマーの 3 ' 末端をコドンの 3 番目の位置で終結させるべきではありません。付属プライマーを使用する場合は、コドン使用表を参照し、生物学的優先性に注意し、3' 末端に付属プライマーを使用せず、高濃度のプライマー (1uM ～ 3uM) を使用してください。

7. プライマーの二次構造

プライマー自体に相補的な配列があってはなりません。そうしないと、プライマー自体がヘアピン構造に折り畳まれ、この二次構造が立体障害によりプライマーとテンプレートの結合に影響を及ぼします。人為的判断を行う場合には、プライマー自体の連続する相補塩基が 3bp を超えないようにしてください。2 つのプライマー間に相補性があってはなりません。特に、プライマーダイマーの形成を防ぐために 3' 末端の相補的な重複は避けるべきです。一般に、一対のプライマー間には連続する塩基の相同性または相補性が 4 つ以下である必要があります。

8. マーカーまたは軌跡を追加する

5' 末端は増幅特異性にほとんど影響を及ぼさないため、増幅特異性に影響を与えることなく修飾できます。プライマー 5' 末端の修飾には、酵素制限部位の追加が含まれます。標識されたビオチン、蛍光、ジゴキシン、Eu3+ など。タンパク質結合 DNA 配列を導入します。突然変異部位の導入、突然変異配列の挿入と欠落、プロモーター配列の導入など。余分な塩基は多かれ少なかれ増幅効率に影響を与え、プライマーダイマー形成の可能性を高めますが、次のステップではある程度の譲歩が必要です。制限部位やプロモーター配列など、標的配列に存在しない追加の配列を、特異性に影響を与えることなくプライマーの 5' 末端に追加できます。これらの配列はプライマー Tm 値の計算には含まれませんが、相補性と内部二次構造についてテストする必要があります。

9. サブクローン

ほとんどの場合、PCR は予備的なクローニングにすぎず、その後、ターゲットフラグメントをさまざまなベクターにサブクローニングする必要があるため、PCR ステップの次の操作のために追加の塩基を設計する必要があります。

サブクローニング用に設計されたいくつかの配列を以下に要約します。
制限エンドヌクレアーゼ制限部位を追加しました

酵素制限部位の追加は、PCR 産物をサブクローニングするために最も一般的に使用される方法です。通常、切断部位は6塩基であり、切断部位の5'末端に加えて2〜3個の保護塩基を追加する必要があります。ただし、酵素ごとに必要な保護塩基の数は異なります。例えば、SalⅠは保護塩基を必要とせず、EcoRⅤは1つの保護塩基を必要とし、NotⅠは2つの保護塩基を必要とし、HindⅢは3つの保護塩基を必要とします。

LIC は尾を追加します

LIC の正式名は Ligation-Independent cloning で、特に pET ベクターの一部のために Navogen によって発明されたクローニング方法です。LIC 法によって調製された pET キャリアは、非相補的な 12 ～ 15 塩基の一本鎖粘着末端を有しており、これはターゲット挿入フラグメント上の対応する粘着末端を補完します。増幅を目的とする場合、挿入断片のプライマー 5' 配列は LIC ベクターを補完する必要があります。T4 DNA ポリメラーゼの 3'→5' エクストラネクト活性により、短時間後に挿入断片上に一本鎖粘着末端が形成されることがあります。生成物は、準備された挿入断片とベクターの相互アニーリングによってのみ形成できるため、この方法は非常に高速かつ効率的であり、直接クローニングです。
指示された TA クローンの追加テール
TA クローニングでは、フラグメントをベクターにターゲットにすることができなかったため、後に Invitrogen は、一端に 4 つの顕著な塩基 GTGGS を含む、クローニングをターゲットにできるベクターを導入しました。したがって、PCR プライマーの設計では、フラグメントを「配向」できるように、それに応じて相補的な配列を追加する必要があります。

時間がない場合は、遺伝子とベクターを組み合わせた直接合成を試すこともできます。これは、筋肉学者の間で ET 遺伝子合成と呼ばれるものです。

D. In-Fusion クローン作成方法

リガーゼは必要なく、長時間の反応も必要ありません。プライマーの設計において線状化ベクターの両端の配列が導入されていれば、PCR 産物と線状化ベクターを BSA を含む融合酵素溶液に添加し、室温で 30 分間放置することで形質転換を行うことができます。この方法は、大量の変換に特に適しています。

10. マージプライマー

場合によっては、プライマー設計に関して限られた配列情報しか知られていないこともあります。例えば、アミノ酸配列だけがわかっていれば、マージプライマーを設計することができる。マージャープライマーは、単一のアミノ酸をコードするさまざまな塩基の可能性をすべて表すさまざまな配列の混合物です。特異性を高めるには、コドン使用表を参照して、さまざまな生物の塩基使用の好みに応じて付加を減らすことができます。ヒポキサンチンはすべての塩基と結合して、プライマーのアニーリング温度を下げることができます。3' 末端の最後の 3 塩基のアニーリングだけで間違った部位で PCR を開始するのに十分であるため、プライマーの 3' 末端に付加された塩基は使用しないでください。多くの併合混合物中のプライマーはターゲットテンプレートに特異的ではないため、より高いプライマー濃度 (1μM ～ 3μM) が使用されます。

*PCR原料コントロール***

1. プライマーの量

各プライマーの濃度は0.1～1umolまたは10～100pmolです。プライマーの量を最小限に抑えて、必要な結果を得ることができます。高濃度のプライマーはミスマッチや非特異的増幅を引き起こし、プライマー間でダイマーが形成される可能性が高くなります。

2. プライマー濃度

プライマーの濃度は特異性に影響します。最適なプライマー濃度は一般に 0.1 ～ 0.5 μM です。プライマー濃度が高くなると、非特異的産物が増幅されます。

3. プライマーのアニール温度

プライマーのもう 1 つの重要なパラメータは融解温度 (Tm) です。これは、プライマーおよび相補配列の 50% が二本鎖 DNA 分子として表される温度です。Tm は PCR アニーリング温度を設定するために必要です。理想的には、アニーリング温度は、プライマーと標的配列との効果的なアニーリングを確実にするのに十分低いが、非特異的結合を低減するのに十分高い温度である。55℃～70℃の適正な焼鈍温度。アニール温度はプライマーのTmより5℃低く設定するのが一般的です。

Tm を設定するにはいくつかの式があり、使用する式やプライマーの配列によって大きく異なります。ほとんどの公式は推定 Tm 値を提供するため、すべてのアニーリング温度は開始点にすぎません。アニーリング温度を段階的に上昇させるいくつかの反応を分析することで、特異性を向上させることができます。推定Tm-5℃以下から開始し、アニーリング温度を2℃ずつ上げていきます。アニーリング温度を高くすると、プライマーダイマーや非特異的生成物の形成が減少します。最良の結果を得るには、2 つのプライマーの Tm 値が近似している必要があります。プライマーペアの Tm 差が 5℃ を超える場合、サイクル内でより低いアニーリング温度を使用すると、プライマーは重大な誤ったスタートを示します。2 つのプライマーの Tm が異なる場合、アニーリング温度は最も低い Tm より 5℃低く設定してください。あるいは、特異性を高めるために、最初に高い Tm 向けに設計されたアニーリング温度で 5 サイクルを実行し、その後、低い Tm 向けに設計されたアニーリング温度で残りのサイクルを実行することもできます。これにより、宛先テンプレートの部分コピーを厳しい条件下で取得できるようになります。

4. プライマーの純度と安定性

カスタムプライマーの標準純度は、ほとんどの PCR アプリケーションに十分です。脱塩によるベンゾイル基およびイソブチリル基の除去は最小限であるため、PCR に干渉しません。一部のアプリケーションでは、合成プロセスで非全長配列を除去するために精製が必要です。これらの切断された配列は、DNA 合成化学の効率が 100% ではないために発生します。これは、各塩基が追加されて DNA が 3' から 5' に形成されるときに化学反応を繰り返す循環プロセスです。どちらのサイクルでも失敗する可能性があります。より長いプライマー、特に 50 塩基を超えるプライマーには、切断された配列が大部分を占めるため、精製が必要になる場合があります。

プライマーの収量は、合成化学の効率と精製方法の影響を受けます。Cytology や Shengong などのバイオ医薬品会社はすべて、オリゴヌクレオシドの総生産量を確保するために最小 OD 単位を使用しています。カスタムプライマーは乾燥粉末の状態で出荷されます。最終濃度が 100μM になるようにプライマーを TE に再溶解するのが最善です。水の pH は酸性であることが多く、オリゴヌクレオシドの加水分解を引き起こすため、TE は脱イオン水よりも優れています。

プライマーの安定性は保管条件によって異なります。乾燥粉末および溶解したプライマーは、-20℃で保管してください。TE に 10μM 以上の濃度で溶解したプライマーは、-20℃で 6 か月間安定に保存できますが、室温 (15℃ ～ 30℃) では 1 週間未満しか保存できません。ドライパウダープライマーは、-20℃で少なくとも 1 年間、室温 (15℃ ～ 30℃) で最長 2 か月間保存できます。

5. 酵素とその濃度

現在使用されている Taq DNA ポリメラーゼは、基本的に大腸菌群によって合成される遺伝子工学用酵素です。典型的な PCR 反応を触媒するのに必要な酵素の量は約 2.5U (総反応量 100ul を指します) です。濃度が高すぎると、非特異的な増幅が起こる可能性があります。濃度が低すぎると、合成生成物の量が減少します。

6. dNTPの品質と濃度

dNTP の品質は、PCR 増幅の濃度と効率に密接に関係しています。dNTP 粉末は顆粒状であり、不適切に保管するとその多様性により生物活性が失われます。dNTP 溶液は酸性であるため、高濃度で使用し、1M NaOH または 1M Tris.HCL 緩衝液で PH を 7.0 ～ 7.5 に調整し、少量の小包装で -20℃ で冷凍保存してください。凍結融解を繰り返すと dNTP が劣化します。PCR反応ではdNTPが50～200umol/Lである必要があります。特に、4 つの DNTPS の濃度が等しいこと (等モル調製) に注意を払う必要があります。どちらか一方の濃度が他と異なる（高いまたは低い）と、ミスマッチが生じます。濃度が低すぎると、PCR 産物の収量が減少します。dNTP は Mg2+ と結合し、遊離 Mg2+ の濃度を下げることができます。

7. 鋳型（標的遺伝子）核酸

鋳型核酸の量と精製度は、PCR の成否を左右する重要な要素の 1 つです。従来の DNA 精製方法では、通常、SDS とプロテアーゼ K を使用して検体を消化して廃棄します。SDS の主な機能は次のとおりです。細胞膜上の脂質とタンパク質を溶解し、膜タンパク質を溶解して細胞膜を破壊し、細胞内の核タンパク質を解離します。SDS はタンパク質と結合して沈殿することもできます。プロテアーゼ K はタンパク質、特に DNA に結合したヒストンを加水分解および消化し、次に有機溶媒フェノールおよびクロロホルムを使用してタンパク質およびその他の細胞成分を抽出し、エタノールまたはイソプロピルアルコールを使用して核酸を沈殿させることができます。抽出された核酸は、PCR 反応のテンプレートとして使用できます。一般的な臨床検出検体の場合、迅速かつ簡単な方法を使用して細胞を溶解し、病原体を溶解し、染色体からタンパク質を消化して除去して標的遺伝子を遊離し、PCR 増幅に直接使用できます。RNA テンプレートの抽出では、通常、RNase による RNA の分解を防ぐために、イソチオシアン酸グアニジンまたはプロテアーゼ K 法が使用されます。

8.Mg2+濃度

Mg2+ は、PCR 増幅の特異性と収量に大きな影響を与えます。一般的な PCR 反応では、各種 dNTP 濃度が 200umol/L の場合、Mg2+ 濃度は 1.5 ～ 2.0mmol/L が適切です。Mg2+ 濃度が高すぎると、反応特異性が低下し、非特異的増幅が発生します。濃度が低すぎると、Taq DNA ポリメラーゼの活性が低下し、反応生成物の減少につながります。

マグネシウムイオンは、収量に影響を与える DNA ポリメラーゼ活性など、PCR のいくつかの側面に影響を与えます。別の例は、特異性に影響を与えるプライマーのアニーリングです。dNTP とテンプレートはマグネシウムイオンに結合し、酵素活性に必要な遊離マグネシウムイオンの量を減らします。最適なマグネシウムイオン濃度はプライマーペアやテンプレートによって異なりますが、200μM dNTP を使用した場合の典型的な PCR 開始濃度は 1.5 mM です (注: リアルタイム定量 PCR の場合は、蛍光プローブを備えた 3 ～ 5 mM マグネシウムイオン溶液を使用してください)。遊離マグネシウムイオンの濃度が高くなると収量は増加しますが、非特異的増幅も増加し、忠実度も低下します。最適な濃度を決定するために、マグネシウムイオン滴定を 1 mM から 3 mM まで 0.5 mM ずつ増分して実行しました。マグネシウムイオンの最適化への依存を減らすために、Platinum Taq DNA ポリメラーゼを使用できます。Platinum Taq DNA ポリメラーゼは、Taq DNA ポリメラーゼよりも広範囲のマグネシウムイオン濃度にわたって機能を維持できるため、最適化の必要性が少なくなります。

9. PCR促進添加剤

アニーリング温度、プライマー設計、およびマグネシウムイオン濃度の最適化は、ほとんどのテンプレートの高度に特異的な増幅に十分です。ただし、GC 含有量が多いテンプレートなど、一部のテンプレートでは追加の対策が必要です。DNA の融解温度に影響を与える添加剤は、製品の特異性と収量を向上させる別の方法を提供します。最良の結果を得るには、テンプレートを完全に変性させる必要があります。

さらに、二次構造によりプライマーの結合と酵素の伸長が妨げられます。

ホルムアミド、DMSO、グリセリン、ベタイン、PCRx Enhancer Solution などの PCR 添加剤は、増幅を強化します。考えられるメカニズムは、融解温度を低下させ、プライマーのアニーリングを助け、二次構造領域を通る DNA ポリメラーゼの伸長を助けることです。PCRx ソリューションには他にも利点があります。Platinum Taq DNA ポリメラーゼおよび Platinum Pfx DNA ポリメラーゼとともに使用する場合、最小限のマグネシウムイオンの最適化が必要です。したがって、プラチナ技術を添加剤と組み合わせて、3 番目のアプローチであるマグネシウムイオン最適化への依存を軽減しながら特異性を高めます。最良の結果を得るには、添加剤、特に Taq DNA ポリメラーゼを阻害する DMSO、ホルムアミド、グリセロールの濃度を最適化する必要があります。

Foreasy Taq DNA ポリメラーゼ

10. ホットスタート

ホットスタート PCR は、適切なプライマー設計に加えて、PCR の特異性を向上させる最も重要な方法の 1 つです。Taq DNA ポリメラーゼの最適伸長温度は 72℃ですが、ポリメラーゼは室温でも活性を保ちます。したがって、PCR 反応の準備中および熱サイクルの開始時に保持温度がアニーリング温度よりも低い場合、非特異的産物が生成されます。これらの非特異的産物は形成されると効果的に増幅されます。ホットスタート PCR は、プライマー設計に使用される部位が、部位特異的突然変異、発現クローニング、または DNA 工学に使用される遺伝子要素の構築と操作などの遺伝要素の位置によって制限されている場合に特に効果的です。

Taq DNA ポリメラーゼの活性を制限する一般的な方法は、氷上で PCR 反応溶液を調製し、予熱した PCR 装置に入れることです。この方法は簡単で安価ですが、酵素の活性を完全に除去するわけではないため、非特異的産物の増幅を完全に排除することはできません。

サーマルプライミングは、PCR 装置が変性温度に達するまで必須成分を阻害することで DNA 合成を遅らせます。Taq DNA ポリメラーゼの遅延添加を含むほとんどの手動熱開始方法は、特にハイスループットのアプリケーションでは面倒です。他のサーマルプライミング方法では、ワックスシールドを使用してマグネシウムイオンや酵素などの必須成分を封入したり、テンプレートやバッファーなどの反応性成分を物理的に隔離したりします。熱サイクル中、ワックスが溶けるにつれてさまざまな成分が放出され、混合されます。手動ホットスタート法と同様に、ワックスシールド法は面倒で汚染されやすいため、高スループットの用途には適していません。

Platinum DNA ポリメラーゼは、自動ホットスタート PCR に便利で効率的です。Platinum Taq DNA ポリメラーゼは、Taq DNA ポリメラーゼに対するモノクローナル抗体と組み合わせた組換え Taq DNA ポリメラーゼで構成されています。抗体は、長時間の温度保持中に酵素活性を阻害するために PCR によって製剤化されます。Taq DNA ポリメラーゼは、変性ステップの 94℃ での保温中に反応中に放出され、完全なポリメラーゼ活性を回復しました。熱開始のために化学的に修飾された Taq DNA ポリメラーゼとは対照的に、Platinum 酵素はポリメラーゼを活性化するために 94℃ (10 ～ 15 分間) での長時間の保温を必要としません。PlatinumTaq DNA ポリメラーゼを使用すると、94℃で 2 分後に Taq DNA ポリメラーゼ活性の 90% が回復しました。

Foreasy HS Taq DNA ポリメラーゼ

11. ネスト PCR

ネステッドプライマーを使用した連続的な増幅により、特異性と感度を向上させることができます。最初のラウンドは 15 ～ 20 サイクルの標準的な増幅です。最初の増幅産物の一部を 100 ～ 1000 倍に希釈し、15 ～ 20 サイクルの 2 回目の増幅に追加しました。あるいは、最初の増幅産物はゲル精製によってサイジングすることもできます。ネステッドプライマーは増幅の 2 ラウンド目に使用され、最初のプライマー内のターゲット配列に結合できます。ネステッド PCR を使用すると、両方のプライマーセットに相補的な標的配列がほとんどないため、複数の標的部位が増幅される可能性が低くなります。同じプライマーを使用した同じ総サイクル数 (30 ～ 40) により、非特異的部位が増幅されました。ネステッド PCR は、限られた標的配列 (例: まれな mRNA) の感度を高め、困難な PCRS (例: 5' RACE) の特異性を改善します。

12. 下降PCR

ディセンディング PCR では、PCR の最初の数サイクルで厳しいアニーリング条件を使用することで特異性が向上します。サイクルは推定 Tm より約 5℃高いアニーリング温度で開始され、その後アニーリング温度が Tm 5℃を下回るまで各サイクルが 1℃ ～ 2℃減少します。相同性が最も高い目的のテンプレートのみが増幅されます。これらの産物はその後のサイクルでも拡大し続け、増幅された非特異的産物を排除します。ディセンディング PCR は、AFLP DNA フィンガープリンティングなど、プライマーとターゲットテンプレート間の相同性の程度が不明な方法に役立ちます。

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