RT-qPCR は分子生物学の基本的な実験であり、誰もがよく知っているはずです。これには主に RNA 抽出、cDNA への逆転写、およびリアルタイム蛍光定量 PCR の 3 つのステップが含まれます。役に立ちません、何が起こっているのですか？問題がある可能性が高いです逆転写実験！逆転写実験はRNA、dNTP、プライマー、逆転写酵素を遠沈管に入れてよく混ぜますが、実際の作業工程ではまだまだ注意すべき点がたくさんあります。それについて学びましょう!

RNA の品質を判断するにはどうすればよいですか?
cDNA を取得するには、RNA の品質が重要です。RNA の品質は主に 2 つの側面から検出できます。
(1) RNA の完全性:RNA の完全性はアガロースゲル電気泳動によって検証できます. 真核生物を例にとると、完全なトータル RNA には 3 つの明確なバンドがあり、分子量は大きいものから小さいものまで 28S、18S、5S であり、28S は 18S の 2 倍の明るさです。3 つのバンドが見られるが、バンドの種類がぼやけているか、拡散している場合は、RNA が部分的に分解されていることを意味します。このとき、すぐに逆転写反応を実行し、テンプレートの入力量を適切に増やしてください。分子量の小さいバンドのみが表示される場合、またはバンドが表示されない場合は、RNA が完全に分解されているため、再抽出する必要があります。Agilent 2100 は、ピーク ダイアグラムと RIN 値で RNA の完全性を示します。核酸が無傷であれば、エレクトロフェログラムのベースラインは平坦になります。核酸が著しく分解されている場合、ベースラインは不均一になり、より多くの分解ピークが現れます。RIN の値は 0 ～ 10 の範囲で RNA の完全性を反映し、値が大きいほど RNA の品質が高くなります。まあ、その分完成度は高いです。
(2) RNA の純度:OD260/280 の比は、UV 分光光度法によって検出できます。OD260/280 の比が 1.9 ～ 2.1 であれば、純度は非常に良好です。
残存ゲノム DNA は不正確な定量的結果を引き起こす可能性があります
RNA を抽出する場合、得られる RNA はクリーンアップされていないゲノム DNA (gDNA) と混合される場合があります。そのため、逆転写後のcDNAも混在してしまいます。gDNA。下流時qPCR反応、cDNAと gDNA が同時に増幅される可能性があるため、CT 値が比較的小さくなり、結果に偏りが生じる可能性があります。
では、この状況では何をすべきでしょうか?フォアジーン示唆する:
(1) 逆向きの RNA に対してゲノムクリーニングを実行します。これは、RNA 抽出中のカラム抽出によって除去できます。
(2) 抽出したRNAをDNaseで処理するI ただし、EDTA で終了します。
逆転写試薬のゲノムクリアリングモジュール付き。

逆転写用のプライマーはどのように選択すればよいですか?
逆転写プライマーも逆転写反応の結果に影響を与えます。実験の特定の状況に応じて、逆転写用のランダム プライマー、オリゴ dT、または遺伝子特異的プライマーを選択できます。
(1) 具体的な成績証明書: 遺伝子特異的プライマーが推奨されます。
(2) 長い断片の転写物: オリゴ dT/遺伝子特異的プライマーが推奨されます。
(3) 長いセグメントの転写産物の内部断片：遺伝子特異的プライマー/ランダムプライマー/ランダムプライマー+オリゴdT。その後の qPCR 実験を実行する場合、Oligo dT を単独で使用すると 3' 末端バイアスが生じ、不正確な qPCR 実験結果が得られる可能性があるため、Oligo dT を単独で使用することはできません。
(4) miRNA: ステムループプライマーまたはテーリングプライマーが使用できます。

逆転写産物 cDNA は定量のために何倍に希釈する必要がありますか?
逆転写産物のcDNAを取得した後、qPCR実験のためにcDNAを何倍に希釈するかは非常に重要です。cDNA濃度が高すぎたり低すぎたりすると、増幅効率に影響が出る場合があります。cDNA 濃度は測定できますか?また、どのように測定すべきですか?
(1) 逆転写産物の cDNA 濃度は測定できません。これは、逆転写産物には cDNA 産物に加えて、逆転写残留バッファー、逆転写酵素、プライマーなどが含まれており、これらが濃度測定結果に干渉し、OD260/280、OD260/230 比の異常を引き起こすため、真の cDNA 収量を反映しません。このとき、友人の中には「精製後の濃度を測定してみます」と言う人もいます。ここで、Foregene は、逆転によって得られる cDNA の長さが異なり、短い cDNA は精製で失われるため、cDNA を精製することはお勧めできません。
(2) それで、どうすればいいでしょうか？qPCR 実験の前に、事前実験を通じて cDNA の希釈勾配を決定できます。例: qPCR 実験のテンプレートとして cDNA ストック溶液、10 倍希釈、および 100 倍希釈を使用し、CT 値が 18 ～ 28 の範囲の希釈倍率を選択します。

miRNA はどのように逆転写されるべきですか?
miRNA は、タンパク質をコードしない約 22 nt のサイズの一本鎖小分子 RNA です。miRNA は長さが短いため、従来の qPCR 法では直接定量することが困難であり、多くの場合 miRNA を伸長する必要があります。miRNA に一般的に使用される逆転写法には、ステムループ法とテーリング法があります。
ステムループ法は、ステムループプライマーを追加することで miRNA を伸長します。この検出方法は感度と特異性が高くなりますが、検出スループットは低くなります。1 つの逆転写では 1 つの miRNA と内部参照のみを検出できます。テール付加法は 2 つの酵素から構成されます。PolyA ポリメラーゼと逆転写酵素の 2 つの酵素の共同作用によって完了します。PolyA ポリメラーゼは miRNA に PolyA テールを付加してその長さを増加させる役割を果たし、逆転写酵素は逆転写反応を実行します。この方法は検出スループットが高く、1 回の逆転写で複数の miRNA と内部参照を検出できますが、ステムループ法では感度と特異性が低くなります。