定量的 PCR または qPCR としても知られるリアルタイム PCR は、PCR 増幅産物をリアルタイムでモニタリングおよび分析するための方法です。
定量的 PCR は操作が簡単、迅速かつ便利、高感度、再現性が良く、汚染率が低いという利点があるため、医療検査、薬効評価、遺伝子発現研究、トランスジェニック研究、遺伝子検出、病原体検出、動植物検出などに広く使用されています。、食品検査などの分野。
したがって、ライフサイエンスの基礎研究に従事している場合でも、製薬会社、畜産会社、食品会社の従業員、さらには出入国検査検疫局、環境監視部門、病院などの部門の従業員であっても、多かれ少なかれ定量的 PCR にさらされるか、または定量的 PCR を習得する知識を知る必要があります。

リアルタイム PCR の原理

リアルタイムPCRは、PCR反応系に蛍光物質を添加し、PCR反応過程における蛍光シグナル強度を定量PCR装置でリアルタイムにモニターし、最終的に実験データを解析・処理する方法です。

【増幅曲線】PCR の動的プロセスを表す曲線です。PCR の増幅曲線は実際には標準指数曲線ではなく、シグモイド曲線です。

【増幅曲線のプラットフォーム位相】PCR サイクル数の増加、DNA ポリメラーゼの不活化、dNTP やプライマーの枯渇、反応副生成物ピロリン酸などによる合成反応の阻害などにより、PCR は必ずしも指数関数的に拡大するとは限りません。、そして最終的にはプラトーに入るでしょう。

【増幅曲線の指数関数的増加領域】プラトー相は大きく異なりますが、増幅曲線の指数関数的増加領域の特定の領域では再現性が非常に優れており、これは PCR の定量分析にとって非常に重要です。

【閾値とCt値】増幅曲線の指数関数的増加領域の適切な位置に蛍光検出の限界値、つまり閾値 (Threshold) を設定します。閾値と増幅曲線の交点が Ct 値です。つまり、Ct 値は閾値に達したときのサイクル数 (Threshold Cycle) を指します。

以下のグラフは、閾値ラインと増幅曲線、閾値とCt値の関係を明確に示しています。

【どのように定量化するのか?】

Ct 値は初期テンプレートの数の対数と逆線形の関係があることが数学理論によって証明されています。リアルタイム PCR は、PCR 増幅産物をリアルタイムで監視し、指数関数的増幅段階で定量します。

PCR の各サイクルで、DNA は 2 倍に指数関数的に増加し、すぐにプラトーに達しました。

出発DNAの量をAとすると、₀ n サイクル後の DNA 産物の理論量は次のように表すことができます。

A _n =A ₀ ×2ⁿ

そして、初期ＤＮＡ量Ａ ０ が大きいほど、増幅産物量は早く検出値Ａｎに到達し、Ａｎに到達するときのサイクル数がＣｔ値となる。すなわち、初期ＤＮＡ量Ａ ０ が多いほど、増幅曲線のピークが早くなり、それに応じて必要なサイクル数ｎは少なくなる。

濃度既知のスタンダードを勾配希釈し、リアルタイムPCRの鋳型として使用すると、開始DNA量が多い方から少ない方へ等間隔で一連の増幅曲線が得られます。Ct 値と開始テンプレート数の対数の間の線形関係によると、[検量線]を作成できます。

濃度未知サンプルのCt値を標準曲線に代入することで、濃度未知サンプルの初期鋳型量を求めることができ、これがリアルタイムPCRの定量原理です。

リアルタイムPCRの検出方法

リアルタイム PCR は、反応系内の蛍光強度を検出することで PCR 増幅産物を検出します。

蛍光色素埋め込み法の原理】

蛍光染料TB Green ® などの分子は、PCR システムで二本鎖 DNA に非特異的に結合し、結合時に蛍光を発します。

反応系内の蛍光強度は、PCR サイクルの増加とともに指数関数的に増加しました。蛍光強度を検出することで、反応系内でのDNA増幅量をリアルタイムにモニタリングし、サンプル中の出発鋳型量を逆推定することができます。

【蛍光プローブ法の原理】

蛍光プローブは、5'末端に蛍光基、3'末端に消光基を備えた核酸配列であり、テンプレートに特異的に結合することができます。プローブが損傷を受けていない場合、フルオロフォアが発する蛍光は消光基によって消光され、蛍光を発することができません。プローブが分解されると蛍光物質が解離して蛍光を発します。

PCR反応液には蛍光プローブが添加されます。アニーリングプロセス中に、蛍光プローブがテンプレートの特定の位置に結合します。伸長過程において、PCR酵素の5'→3'エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型とハイブリダイズした蛍光プローブが分解され、蛍光物質が解離して蛍光を発する。反応系中のプローブの蛍光強度を検出することにより、PCR産物の増幅量をモニタリングするという目的を達成することができる。

【蛍光検出法の選択】

相同性の高い配列を識別し、SNP タイピング解析などのマルチプレックス PCR 検出を行う場合、蛍光プローブ法は欠かせません。
その他のリアルタイム PCR 実験には、シンプル、簡単、低コストの蛍光キメラ法を使用できます。

プローブ強い特異性、マルチプレックス PCR が可能

欠点

増幅には高い特異性が必要です。

マルチプレックス PCR は実行できません。特定のプローブを設計する必要があり、コストが高くなります。

プローブの設計が難しい場合がある

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