従来の逆転写酵素は高温に耐えることができません（MMLV 活性の最適温度は 37 ～ 50 ℃、AMV 活性の最適温度は 42 ～ 60 ℃）。より複雑なウイルス RNA は、低温では効果的に cDNA に逆転写できず、検出効率が低下します。従来のRT-qPCRでは一般に2つの主要な酵素（逆転写酵素とDNAポリメラーゼ）の関与が必要であるため、反応系の操作を簡素化しコストを削減することができません。ここでは、2つの高温耐性逆転写酵素、TtHとRevTaqを紹介します。この 2 つの酵素は DNA ポリメラーゼの機能も併せ持つため、二機能性酵素と呼ばれます。

TtH DNA ポリメラーゼ

好熱性細菌 Thermus Thermophilus HB8 に由来する TtH について聞いたことがあるでしょう。Mg2+ などの二価陽イオンの存在下では、DNA ポリメラーゼ活性があります。Taq 酵素と同様に PCR 反応に広く使用されていますが、Taq 酵素よりも耐熱性が高いため、GC 含有量の高いテンプレートを使用する PCR にも優れた効果を発揮します。

・本酵素は基本的に3'→5'エキソヌクレアーゼ活性と5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を持たないため、ジデオキシシーケンシングにも使用できます。

・この酵素はRTase活性を持っています。Mn2+ の存在下では、RTase 活性が強化されます。この特徴を利用して、逆転写反応とPCR反応を同一チューブ内で行うワンステップRT-PCRが可能です。ただし、Mn2+ の存在下では RT-PCR の精度は高くありません。RT 活性は rnase H 活性とは何の関係もありません。

・Tth-DNAポリメラーゼの活性向上（pH9、至適+55℃～+70℃、最大+95℃）により、RNAの二次構造に起因する問題を克服します。得られた cDNA は、Mg2+ イオンの存在下で同じ酵素を用いた PCR によって増幅できます。

· Tth-DNA ポリメラーゼは高温で逆転写および DNA 増幅を実行できるため、この酵素は定量的 RT-PCR、クローニング、および細胞およびウイルス RNA の遺伝子発現分析に役立ちます。
· Tth-DNA ポリメラーゼは RT-PCR に使用され、最大 1kb の RNA を増幅します。

特徴と利点

T番目のDNAポリメラーゼ:

• 最適化されたポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 製品サイズ (RT-PCR 反応で少なくとも 1000 bp) を確保します。

• 修飾デオキシリボヌクレオシド三リン酸を基質として受け入れる

• RNase H 活性とは無関係

• 熱安定性が高く、通常 RNA に存在する高度な二次構造に関連する問題を克服します。

RevTaq RT-PCR DNA ポリメラーゼ

逆転写酵素活性を持つ耐熱性DNAポリメラーゼ

RevTaq-RT-PCR-DNA ポリメラーゼは、方向性のある人工進化によって得られる逆転写酵素活性と DNA ポリメラーゼ活性を備えた、工学的に設計された高耐熱性の二重機能酵素です。

· RevTaq RT-PCR DNA ポリメラーゼの 95°C での半減期は 40 分を超えます。

· RevTaq RT-PCR DNA ポリメラーゼは、RNA テンプレートから直接高温逆転写を可能にし、逆転写ステップを複数回繰り返してより多くの cDNA テンプレートを生成できます。

· RevTaq RT-PCR DNA ポリメラーゼは、サイクリック PCR 伸長ステップで逆転写と DNA 増幅が同時に起こるため、「ゼロステップ」RT-PCR (等温逆転写ステップなし) を可能にします。これにより、高温での逆転写反応も促進されるため、高温で RNA の強力な二次構造が融解する際に遭遇する問題が最小限に抑えられます。

· RevTaq RT-PCR DNA ポリメラーゼは、アプタマー ベースのホット スタート フォーミュラにより、アニーリングおよび伸長温度が 57°C より高い場合により良い結果をもたらします。

· 酵素は耐熱性があるため、融点が非常に高い (>60°C) プライマーとプローブを設計することをお勧めします。

· 反応セットアッププロセス中の温度勾配により、アニーリング/伸長ステップの温度を最適化することをお勧めします。

· 温度が高いほど、PCR の特異性は高くなります。DNA プライマー:RNA テンプレートのハイブリダイゼーションは通常、DNA プライマー:cDNA テンプレートの二本鎖よりも融点が高いため、逆転写サイクルは通常、PCR サイクルよりも高い温度で実行されます。

· RevTaq RT-PCR DNA ポリメラーゼは遺伝子操作され最適化されており、アンプリコン サイズは 60 ～ 300 bp です。

RevTaq RT-PCR DNA ポリメラーゼの検出限界は 4 コピー/個に達します

最適化された反応系（高融点プライマーの確立）を図に示します。RevTaq RT-PCR DNA ポリメラーゼ駆動の RT-PCR は、TaqPath 1 ステップ RT-qPCR マスター ミックスよりも感度が高く、検出サンプルの希釈勾配が低くなります。

その他の利点:

クイックスタート機能 → 最初の熱変性工程を省略可能。

ホットスタート アプタマー フォーミュラ → 100% の酵素活性を即座に提供し、低温 (<57°C) での非特異的増幅を防止します。

切断機能 → RevTaq RT-PCR DNA ポリメラーゼは粗反応サンプルも処理できるため、RNA 抽出ステップが省略されます。ホット RT-PCR サイクルで真核生物、細菌、ウイルスの細胞膜を即座に破壊できます。

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