ニュース - RT-PCR実験反応系最適化手法詳細まとめ

Ⅰ. 反応システムの感度を高めます。

1. 高品質 RNA を分離します。

cDNA 合成の成功は、高品質の RNA から得られます。高品質の RNA は、少なくとも全長が長く、EDTA や SDS などの記録酵素を含まない阻害剤を含まない必要があります。RNA の品質によって、cDNA に転写できる配列情報の最大値が決まります。一般的なRNA精製方法はイソシアネート/アシドフェノールを用いるステップ法です。RNase の汚染を防ぐために、RNase が豊富に含まれるサンプル (膵臓など) から RNA を分離するには、高品質の RNA を保存するためにホルムアルデヒドを保管する必要があり、長期保管の場合はさらにその必要があります。ラットの肝臓から抽出した RNA は、水中で 1 週間保存すると基本的に分解されましたが、ラットの脾臓から抽出した RNA は、水中で 3 年間保存しても安定でした。さらに、4 kb を超える転写物は、小さな転写物よりも微量の RNase 分解に対してより敏感です。保存 RNA サンプルの安定性を高めるために、RNA をメタルアミンイオンに溶解し、-70 °C で保存します。RNA の保存に使用されるチライドには、RNA を分解するさまざまな物質が含まれていてはなりません。膵臓由来の RNA は、メタルマミン中で少なくとも 1 年間保存できます。RNA を使用する準備ができたら、次の方法を使用して RNA を沈殿させることができます: NaCl を 0.2 μm に加え、エタノールの 4 倍量を加え、室温に 3 ～ 5 分間放置し、10,000 × g で 5 分間遠心分離します。

2. RNaseH 活性のない逆転写酵素 (RNaseH-) を使用します。

RNase 阻害剤は、cDNA 合成の長さと収量を増加させるために逆転写反応に添加されることがよくあります。RNase 阻害剤は、緩衝液および DTT などの還元剤の存在下で最初の鎖合成反応に添加されます。これは、cDNA 前合成プロセスによって阻害剤が変性され、それによって RNA を分解する結合 RNase が放出されるためです。プロテイン RNase インヒビターは、RNase A、B、C による RNA の分解を防ぐだけで、皮膚上の RNase は妨げないため、これらのインヒビターを使用したにもかかわらず、指から RNase を持ち込まないよう注意する必要があります。

逆転写酵素は、RNA から cDNA への変換を触媒します。M-MLV と AMV は両方とも、それら自体のポリメラーゼ活性に加えて、内因性 RNaseH 活性を持っています。RNaseH 活性は、RNA 鋳型と DNA プライマーまたは cDNA 延長鎖の間に形成されるヘテロ接合鎖のポリメラーゼ活性と競合し、DNA 複合体中の RNA: RNA 鎖を分解します。RNaseH 活性によって分解された RNA テンプレートは、cDNA 合成の有効な基質として使用できなくなり、cDNA 合成の収量と長さが減少します。したがって、逆転写酵素のRNaseH活性を除去または大幅に低下させることは、非常に有益であろう。

SuperScript II 逆転写酵素、RNaseH の MMLV 逆転写酵素、および RNaseH の ThermoScript 逆転写酵素、AMV は、MMLV および AMV よりも多くの完全長 cDNA を生成しました。RT-PCR 感度は合成される cDNA の量に影響されます。ThermoScript は AMV よりもはるかに敏感です。RT-PCR 産物のサイズは、特に大きな Cdna をクローニングする場合、cDNA を合成する逆転写酵素の能力によって制限されます。MMLV と比較して、SuperScripⅡは長い RT-PCR 産物の収量を大幅に増加させました。RNaseH-の逆転写酵素は熱安定性も高めるため、通常の37～42℃よりも高い温度で反応を行うことができます。提案された合成条件下で、オリゴ(dT)プライマーおよび10μCiのα-p]dCTPが使用された。最初のチェーンの総生産量は、TCA 沈殿法を使用して計算されました。完全長 cDNA は、サイズ分類されたストリップ除去とアルカリ性アガロースゲルでの計数を使用して分析されました。

3.逆転写の保存温度を上げる：

保持温度を高くすると、RNA の二次構造が開き、反応収量が増加します。ほとんどの RNA テンプレートでは、バッファーや塩を使用せずに RNA とプライマーを 65°C に保持し、氷上で急速に冷却すると、ほとんどの二次構造が除去され、プライマーが結合できるようになります。ただし、一部のテンプレートは熱変性後でも二次構造を保持しています。これらの困難なテンプレートの増幅は、ThermoScript 逆転写酵素を使用し、逆転写酵素反応を高温にして増幅を向上させることで実行できます。特に遺伝子特異的プライマー (GSPS) を使用して cDNA 合成を行う場合、保持温度を高くすると特異性が高まる可能性があります (第 3 章を参照)。GSP を使用する場合は、プライマーの Tm 値が予想される保持温度と同じであることを確認してください。オリゴ(dT)プライマーやランダムプライマーは60℃以上で使用しないでください。ランダムプライマーは、60℃に上げる前に25℃で10分間保持する必要があります。より高い逆転写温度を使用することに加えて、RNA/プライマー混合物を65℃の変性温度から逆転写保持温度に直接移し、予熱した2×反応混合物を添加する(cDNA熱開始合成)ことによって、特異性を改善することができます。このアプローチは、低温で発生する分子間塩基対形成を防ぐのに役立ちます。PCR 装置を使用すると、RT-PCR に必要な多くの温度スイッチが簡素化されます。

熱安定化ポリメラーゼは、Mg2+ の存在下では DNA ポリメラーゼとして機能し、Mn2+ の存在下では RNA ポリメラーゼとして機能します。65℃までの保温が可能です。ただし、PCR 中に Mn2+ が存在すると忠実度が低下するため、Tth ポリメラーゼは cDNA クローニングなどの高精度増幅には適さなくなります。さらに、Tth は逆転写効率が低く、感度が低下します。また、単一の酵素で逆転写と PCR を実行できるため、逆転写を行わないコントロール反応を使用して cDNA の増幅産物と汚染されたゲノム DNA の増幅産物を区別することはできません。

4. 逆転写を促進する添加剤：

グリセリンやDMSOなどの添加剤を最初の鎖合成反応に加えると、核酸二本鎖の安定性が低下し、RNAの二次構造がほどける可能性があります。SuperScriptⅡまたはMMLVの活性に影響を与えることなく、最大20%のグリセリンまたは10%のDMSOを添加できます。AMV は、活性を低下させることなく最大 20% のグリセロールにも耐えることができます。SuperScriptⅡ逆転写反応におけるRT-PCRの感度を最大化するために、10%グリセロールを添加し、45℃で保温することができます。逆転写反応産物の 1/10 が PCR に添加された場合、増幅反応中のグリセロールの濃度は 0.4% ですが、これは PCR を阻害するには十分ではありません。

5.RNaseH処理：

PCR の前に cDNA 合成反応を RNaseH で処理することで感度を向上させることができます。一部のテンプレートでは、cDNA 合成反応中の RNA が増幅産物の結合を妨げると考えられており、その場合、RNaseH 処理により感度が向上する可能性があります。一般に、コピー数の少ない結節性硬化症Ⅱなど、比較的長い全長cDNAターゲットテンプレートの増幅にはRNaseH処理が必要です。この困難なテンプレートに対して、RNaseH は SuperScriptⅡ または AMV によって合成された cDNA によって生成されるシグナルを増強しました。ほとんどの RT-PCR 反応では、RNaseH 処理はオプションです。これは、95℃ の断熱 PCR 変性ステップでは通常、RNA: DNA 複合体から RNA が加水分解されるためです。

6. 微量 RNA を検出するための改良された方法：

RT-PCR は、RNA が少量しか入手できない場合に特に困難です。RNA 分離中に担体としてグリコーゲンを添加すると、少量のサンプルの収量が増加します。RNase フリーのグリコーゲンを Trizol と同時に添加できます。グリコーゲンは水溶性であり、RNA とともに水相に残り、その後の沈殿を助けることができます。RNase フリーグリコーゲンの推奨濃度は、50 mg 未満の組織または 106 個の培養細胞のサンプルでは 250 μg/ml です。

SuperScriptⅡを使用した逆転写反応にアセチル化BSAを添加すると感度が向上します。また、少量のRNAの場合はSuperScriptⅡの量を減らし、RnaseOutヌクレアーゼ阻害剤を40ユニット添加すると検出レベルが向上します。RNA 分離にグリコーゲンを使用する場合でも、SuperScriptⅡを使用した逆転写反応に BSA または RNase 阻害剤を添加することをお勧めします。

Ⅱ. RT-PCRの特異性を高める

1.cNDA合成：

第一鎖 cDNA 合成を開始するには 3 つの異なる方法が使用でき、各方法の相対的な特異性が合成される cDNA の量と種類に影響します。

ランダムプライマー法は、3 つの方法の中で最も特異性が低くなります。プライマーは転写産物全体の複数の部位でアニーリングされ、短い部分長の cDNA が生成されます。この方法は、逆転写酵素が複製できない二次構造領域または終結部位を持つ RNA テンプレートから 5' 末端配列と cDNA を取得するためによく使用されます。最長の cDNA を取得するには、各 RNA サンプルにおけるプライマーと RNA の比率を経験的に決定する必要があります。ランダムプライマーの初期濃度は、20μl 反応系あたり 50 ～ 250ng の範囲です。ランダムプライマーを用いてtotal RNAから合成されるcDNAは主にリボソームRNAであるため、一般的にポリ(A)+RNAが鋳型として選択されます。

オリゴ(dT)開始はランダムプライマーよりも特異的です。ほとんどの真核細胞の mRNA の 3' 末端にあるポリ (A) テールとハイブリダイズします。ポリ(A)+RNA は総 RNA のおよそ 1% ～ 2% であるため、cDNA の量と複雑さはランダムプライマーを使用した場合よりもはるかに少なくなります。オリゴ(dT)は特異性が高いため、通常、RNAとプライマーの比率やポリ(A)+選択の最適化を必要としません。20μl 反応系あたり 0.5μg オリゴ(dT) を使用することをお勧めします。oligo(dT)12-18 はほとんどの RT-PCR に適しています。ThermoScript RT-PCR システムは、優れた熱安定性によりオリゴ(dT)20 を提供し、より高い保持温度に適しています。

遺伝子特異的プライマー (GSP) は、逆転写ステップに最適な特異的プライマーです。GSP は、ランダムプライマーやオリゴ (dT) のようにすべての RNA をアニールするのではなく、RNA 宛先配列と特異的にハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオシドです。PCR プライマーの設計に使用されるルールは、逆転写反応 GSP の設計にも適用されます。ＧＳＰは、ｍＲＮＡ３'の末端でアニーリングされる増幅プライマーと同じ配列であってもよく、またはＧＳＰは、下流で逆増幅プライマーとアニーリングされるように設計されてもよい。増幅対象によっては、標的 RNA の二次構造によりプライマーの結合が妨げられる場合があるため、RT-PCR を成功させるためには複数のアンチセンスプライマーを設計する必要があります。20μlの第一鎖合成反応系には1pmolのアンチセンスGSPを使用することが推奨されます。

2.逆転写の保存温度を上げる：

GSP の特異性を最大限に活用するには、熱安定性の高い逆転写酵素を使用する必要があります。熱安定性逆転写酵素は、反応の厳密性を高めるために高温で絶縁することができます。たとえば、GSP が 55°C でアニーリングされた場合、AMV または M-MLV を使用して逆転写が 37°C で低精度で実行されると、GSP の特異性が十分に活用されません。しかし、SuperScripⅡやThermoScriptは50℃以上でも反応するため、それより低い温度で生成する非特異的な生成物を除去できます。特異性を最大限に高めるために、予熱した 2 × 反応混合物を添加することで、RNA/プライマー混合物を 65℃ の変性温度から逆転写保持温度まで直接移動させることができます (cDNA 合成の熱的開始)。これは、低温での分子間の塩基対形成を防ぐのに役立ちます。PCR 機器を使用すると、RT-PCR に必要な多くの温度移行が簡素化されます。

3. ゲノムDNAの汚染を軽減：

RT-PCR の潜在的な問題の 1 つは、RNA がゲノム DNA を汚染することです。Trizol 試薬などのより優れた RNA 分離方法を使用すると、RNA 調製物中のゲノム DNA の汚染が減少します。ゲノム DNA から生成される産物を避けるために、RNA を増幅グレードの DnasⅠ で処理して、逆転写前に汚染された DNA を除去することができます。サンプルを 2.0 mM EDTA 中で 65℃ で 10 分間保持して、DNase I 消化を停止させました。EDTA はマグネシウムイオンをキレート化し、高温で起こるマグネシウムイオン依存性の RNA 加水分解を防ぎます。

増幅されたcDNAをゲノムDNA増幅産物から分離するために、分離されたエクソンと別々にアニーリングするプライマーを設計することができます。cDNA に由来する PCR 産物は、汚染されたゲノム DNA に由来するものよりも短くなります。逆転写を行わない対照実験も各 RNA テンプレートに対して実行され、特定のフラグメントがゲノム DNA または cDNA に由来するかどうかが決定されます。逆転写の非存在下で得られる PCR 産物はゲノムに由来します。

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