一、反応系の感度を上げる：

1. 高品質 RNA の分離：

cDNA 合成の成功は、高品質の RNA から得られます。高品質の RNA は少なくとも全長であり、EDTA や SDS などの逆転写酵素阻害剤が含まれていない必要があります。RNA の品質によって、cDNA に転写できる配列情報の最大量が決まります。一般的な RNA 精製方法は、イソチオシアン酸グアニジン/酸性フェノールを使用するワンステップ法です。微量の RNase による汚染を防ぐため、RNase が豊富なサンプル (膵臓など) から単離した RNA は、特に長期保存の場合、高品質の RNA を保存するためにホルムアルデヒドで保存する必要があります。ラットの肝臓から抽出した RNA は水中で 1 週間保存すると基本的に分解されましたが、ラットの脾臓から抽出した RNA は水中に 3 年間保存しても安定でした。さらに、4 kb より長い転写物は、小さな転写物よりも微量 RNase による分解に対してより敏感です。保存された RNA サンプルの安定性を高めるために、RNA を脱イオンホルムアミドに溶解し、-70°C で保存できます。RNA の保存に使用されるホルムアミドには、RNA を分解する破片が含まれていてはなりません。膵臓からの RNA はホルムアミド中で少なくとも 1 年間保存できます。RNA を使用する準備をする場合は、次の方法で RNA を沈殿させることができます: NaCl を 0.2 M に加え、エタノールの 4 倍量を加え、室温に 3 ～ 5 分間置き、10,000 xg で 5 分間遠心分離します。

2. RNaseH 不活性 (RNaseH-) 逆転写酵素を使用します。

RNase 阻害剤は、cDNA 合成の長さと収量を増加させるために逆転写反応に添加されることがよくあります。RNase 阻害剤は、バッファーおよび還元剤 (DTT など) の存在下で第一鎖合成反応中に添加する必要があります。これは、cDNA 合成前のプロセスで阻害剤が変性し、それによって結合した RNase が放出され、RNA を分解する可能性があるためです。プロテイン RNase 阻害剤は、RNase A、B、C による RNA の分解を防ぐだけで、皮膚上の RNase は妨げないため、これらの阻害剤を使用しているにもかかわらず、指から RNase が侵入しないように注意してください。

逆転写酵素は、RNA から cDNA への変換を触媒します。M-MLV と AMV は両方とも、それら自体のポリメラーゼ活性に加えて、内因性 RNaseH 活性を持っています。RNaseH 活性とポリメラーゼ活性は、RNA テンプレートと DNA プライマーまたは cDNA 延長鎖の間に形成されるハイブリッド鎖をめぐって互いに競合し、RNA:DNA 複合体の RNA 鎖を分解します。RNaseH 活性によって分解された RNA テンプレートは、cDNA 合成の有効な基質として機能できなくなり、cDNA 合成の収量と長さが減少します。したがって、逆転写酵素のRNaseH活性を除去するか大幅に低下させることが有益と考えられます。

SuperScript Ⅱ逆転写酵素 RNaseH-MMLV 逆転写酵素、thermoScript 逆転写酵素 RNaseH-AMV は、MMLV や AMV よりも大量かつ全長の cDNA を取得できます。RT-PCR 感度は cDNA 合成量に影響されます。ThermoScript は AMV よりもはるかに敏感です。RT-PCR 産物のサイズは、特に大きな cDNA をクローニングする場合、cDNA を合成する逆転写酵素の能力によって制限されます。MMLV と比較して、SuperScripⅡは長い RT-PCR 産物の収量を大幅に増加させました。RNaseH 逆転写酵素は熱安定性も向上しているため、通常の 37 ～ 42°C よりも高い温度で反応を実行できます。提案された合成条件下で、オリゴ(dT) プライマーと 10 μCi の [α-P]dCTP を使用します。最初のストランドの総収量は、TCA 沈殿法を使用して計算されました。サイズ分類されたバンドを使用して全長 cDNA を分析し、アルカリアガロースゲルで切り出し、計数しました。

3. 逆転写のためにインキュベーション温度を上げる：

インキュベーション温度を高くすると、RNA の二次構造が開きやすくなり、反応収量が増加します。ほとんどの RNA テンプレートでは、バッファーや塩を使用せずに RNA とプライマーを 65°C でインキュベートし、その後氷上で急速に冷却すると、ほとんどの二次構造が除去され、プライマーが結合できるようになります。ただし、一部のテンプレートは熱変性後でも二次構造を保持しています。これらの困難なテンプレートの増幅は、ThermoScript Reverse Transcriptase を使用し、逆転写反応を高温にして増幅を向上させることで実行できます。インキュベーション温度を高くすると、特に cDNA 合成に遺伝子特異的プライマー (GSP) を使用する場合、特異性が高まる可能性があります (第 3 章を参照)。GSP を使用する場合は、プライマーの Tm が予想されるインキュベーション温度と同じであることを確認してください。オリゴ(dT)およびランダムプライマーは60℃以上で使用しないでください。ランダムプライマーは、60℃に上げる前に 25℃で 10 分間インキュベートする必要があります。より高い逆転写温度を使用することに加えて、RNA/プライマー混合物を65℃の変性温度から逆転写インキュベーション温度に直接移し、予熱した2×反応混合物を添加することによっても特異性を改善することができます(cDNAホットスタート合成)。このアプローチは、低温で発生する分子間塩基対形成を防ぐのに役立ちます。RT-PCR に必要な複数の温度切り替えは、サーマルサイクラーを使用することで簡素化できます。

Tth 熱安定性ポリメラーゼは、Mg2+ の存在下では DNA ポリメラーゼとして機能し、Mn2+ の存在下では RNA ポリメラーゼとして機能します。最高65℃まで保温が可能です。ただし、PCR 中に Mn2+ が存在すると忠実度が低下するため、Tth ポリメラーゼは cDNA のクローニングなどの高精度増幅には適さなくなります。さらに、Tth は逆転写効率が低いため感度が低下し、逆転写と PCR を単一の酵素で実行できるため、逆転写を行わないコントロール反応を使用して cDNA 増幅産物と混入ゲノム DNA を比較することはできません。増幅産物を分離した。

4. 逆転写を促進する添加剤：

グリセロールやDMSOなどの添加剤が第一鎖合成反応に加えられるため、核酸二本鎖の安定性が低下し、RNAの二次構造が解けてしまう可能性があります。SuperScript II または MMLV の活性に影響を与えることなく、最大 20% のグリセロールまたは 10% の DMSO を追加できます。AMV は、活性を失うことなく最大 20% のグリセロールにも耐えることができます。SuperScript II 逆転写反応における RT-PCR の感度を最大化するために、10% グリセロールを添加して 45°C でインキュベートできます。逆転写反応産物の 1/10 が PCR に添加された場合、増幅反応中のグリセロールの濃度は 0.4% ですが、これは PCR を阻害するには十分ではありません。

5. RNaseH処理：

PCR の前に cDNA 合成反応を RNaseH で処理すると、感度が向上します。一部のテンプレートでは、cDNA 合成反応中の RNA が増幅産物の結合を妨げると考えられており、その場合、RNaseH 処理により感度が向上する可能性があります。一般に、低コピー結節性硬化症 II など、より長い完全長 cDNA ターゲットテンプレートを増幅する場合は、RNaseH 処理が必要です。この困難なテンプレートでは、RNaseH 処理により、SuperScript II または AMV で合成された cDNA によって生成されるシグナルが強化されました。ほとんどの RT-PCR 反応では、RNaseH 処理はオプションです。95°C での PCR 変性ステップでは、一般に RNA:DNA 複合体の RNA が加水分解されるためです。

6. Small RNA 検出法の改良：

RT-PCR は、RNA が少量しか入手できない場合に特に困難です。RNA 分離中にキャリアとしてグリコーゲンを添加すると、少量のサンプルの収量が増加します。RNase フリーのグリコーゲンは Trizol の添加と同時に添加できます。グリコーゲンは水溶性であり、RNA とともに水相に保持され、その後の沈殿を助けることができます。50 mg 未満の組織または 106 個の培養細胞のサンプルの場合、RNase フリー グリコーゲンの推奨濃度は 250 μg/ml です。

SuperScript II を使用した逆転写反応にアセチル化 BSA を追加すると感度が向上し、RNA が少量の場合は SuperScript II の量を減らし、RNaseOut ヌクレアーゼ阻害剤を 40 ユニット追加すると検出レベルが向上します。RNA 単離プロセスでグリコーゲンが使用される場合でも、逆転写反応に SuperScript II を使用するときに BSA または RNase 阻害剤を追加することをお勧めします。

二、RT-PCRの特異性を高める

1. CND合成：

第一鎖 cDNA 合成は 3 つの異なる方法を使用して開始でき、その相対的な特異性が合成される cDNA の量と種類に影響します。

ランダム プライマー法は、3 つの方法の中で最も特異性が低かった。プライマーは転写産物全体の複数の部位でアニールし、短い部分長の cDNA を生成します。この方法は、5' 末端配列を取得したり、逆転写酵素では複製できない二次構造の領域または終結部位を含む RNA テンプレートから cDNA を取得したりするためによく使用されます。最長の cDNA を取得するには、各 RNA サンプルにおけるプライマーと RNA の比率を経験的に決定する必要があります。ランダムプライマーの開始濃度は、20 μl 反応あたり 50 ～ 250 ng の範囲でした。ランダムプライマーを使用してトータルRNAから合成されるcDNAは主にリボソームRNAであるため、一般的にポリ(A)+RNAが鋳型として選択されます。

オリゴ(dT)プライマーはランダムプライマーよりも特異的です。ほとんどの真核生物の mRNA の 3' 末端にあるポリ (A) テールにハイブリダイズします。ポリ(A)+ RNA は全 RNA の約 1% ～ 2% であるため、cDNA の量と複雑さはランダム プライマーを使用する場合よりもはるかに少なくなります。オリゴ(dT)は特異性が高いため、一般にプライマーに対するRNAの比率の最適化やポリ(A)+の選択を必要としません。20μl 反応系あたり 0.5μg オリゴ(dT) を使用することをお勧めします。oligo(dT)12-18 はほとんどの RT-PCR に適しています。ThermoScript RT-PCR システムは、より高いインキュベーション温度での熱安定性が優れているため、oligo(dT)20 を提供します。

遺伝子特異的プライマー (GSP) は、逆転写ステップに最も特異的なプライマーです。GSP は、すべての RNA にアニールするランダム プライマーやオリゴ (dT) とは異なり、RNA 標的配列に特異的にハイブリダイズできるアンチセンス オリゴヌクレオチドです。PCR プライマーの設計に使用されるのと同じルールが、逆転写反応における GSP の設計に適用されます。ＧＳＰは、ｍＲＮＡの３'末端にアニールする増幅プライマーと同じ配列であってもよいし、逆増幅プライマーの下流にアニールするようにＧＳＰを設計してもよい。一部の増幅対象では、標的 RNA の二次構造がプライマー結合を妨げる可能性があるため、RT-PCR を成功させるために複数のアンチセンス プライマーを設計する必要があります。20 μl のファーストストランド合成反応では 1 pmol のアンチセンス GSP を使用することが推奨されます。

2. 逆転写のためにインキュベーション温度を上げる：

GSP の特異性の利点を最大限に活用するには、より高い熱安定性を備えた逆転写酵素を使用する必要があります。熱安定性逆転写酵素は、反応のストリンジェンシーを高めるために高温でインキュベートできます。たとえば、GSP が 55°C でアニーリングする場合、AMV または M-MLV を 37°C の低いストリンジェンシーで逆転写に使用すると、GSP の特異性が十分に活用されません。ただし、SuperScript II および ThermoScript は 50°C 以上で反応するため、それより低い温度で生成される非特異的な生成物は排除されます。特異性を最大限に高めるために、RNA/プライマーミックスを65℃の変性温度から逆転写インキュベーション温度に直接移し、あらかじめ温めておいた2×反応ミックスに加えることができます(cDNA合成ホットスタート)。これは、低温での分子間塩基対形成の防止に役立ちます。RT-PCR に必要な複数の温度遷移は、サーマル サイクラーを使用することで簡素化できます。

3. ゲノムDNAの汚染を軽減：

RT-PCR で直面する潜在的な問題は、RNA へのゲノム DNA の混入です。Trizol 試薬などの優れた RNA 単離法を使用すると、RNA 調製物に混入するゲノム DNA の量が減少します。ゲノム DNA に由来する生成物を避けるために、逆転写の前に RNA を増幅グレードの DNase I で処理して、混入している DNA を除去します。DNase I消化は、サンプルを2.0 mM EDTA中で65℃で10分間インキュベートすることによって終了させました。EDTA はマグネシウムイオンをキレート化し、高温でのマグネシウムイオン依存性の RNA 加水分解を防止します。

増幅された cDNA を混入ゲノム DNA 増幅産物から分離するために、それぞれが別々のエクソンにアニールするプライマーを設計できます。cDNA に由来する PCR 産物は、汚染されたゲノム DNA に由来するものよりも短くなります。さらに、逆転写を行わない対照実験を各 RNA テンプレートに対して実行し、特定のフラグメントがゲノム DNA に由来するのか、cDNA に由来するのかを判定しました。逆転写を行わずに得られる PCR 産物はゲノムに由来します。