qRT-PCR 実験の原理、プライマー設計、結果の解釈などについて皆さんが話していますが、私は qRT-PCR の実験操作について共有する必要があると思います。小さいことですが、結果が大事です。
qRT-PCR を行う前に、自分の RNA と操作方法を明確に理解する必要があります。結局のところ、私たちの努力は単に練習するのではなく、結果を出すことを目的としています。したがって、qRT-PCR を実行する前に、次の問題を判断する必要があります (そのうちのいくつかは SYBR にのみ適用されます)。
1 RNA が分解されていないと確信していますか?
NanoDrop 2000 は RNA の濃度と純度のみを検出できますが、RNA の完全性は検出できません。
RNA (RNA Intesity Number) 値は、Agilent 2100 Bioanalyzer システムによって検出される RNA の完全性を反映します。
図. さまざまな RNA サンプル (真核生物) の RIN 値の概略図
ただし、通常、研究室には Agilent 2100 バイオアナライザはありません。この場合、ホルムアルデヒドゲルでも検出できますが、RNA の総量が多く必要となるため、通常のゲル電気泳動を使用するのが最も早い方法です。ヌクレアーゼフリーの環境である必要があるため、電気泳動タンク、ゾルボトル、ゲルブラケット、コームを DEPC 水ですすぐ必要があります。アガロースにはヌクレアーゼも含まれておらず (新たに開封されたものである限り)、ローディング バッファーは 1.2% ゲルを使用し、できるだけ新たに開封されたものである必要があります。
図のサンプル 9 に示すように、ゲルは完全に溶解する必要があることに注意してください。溶解しないと不均一なバンドが発生します。電圧が高すぎたり、長時間動作させたりすると、発熱して RNA が劣化するため、電圧と時間を適切に制御する必要があります。さらに、ゲルの泳動により、サンプル中に DNA 残基があるかどうかをさらに判断し、分注ウェルに多数のバンドが保持されているかどうかを観察することもできます。
形。RNAのゲル電気泳動検出
2 cDNA の濃度は確かですか?
研究室の兄貴たちの経験では、各反転によって得られた 20 μl システムの cDNA は直接 20 倍に希釈されますが、博士研究員の姉妹たちは 10 倍に希釈されます。私は通常、状況に依存します。人によって挙げられるRNAの品質が異なるため、反転のレベルも異なり、反転技術が安定しない可能性があります。
したがって、反転 cDNA を取得するたびに、まずそれを約 3 倍に希釈し、次にハウスキーピング遺伝子を使用して RT-PCR を実行します。サイクル数は通常 25 サイクルで、特定の濃度を特定し、最終的な希釈率を決定します。
3 あなたのプライマーは使いやすいと確信していますか？
qRT-PCR の融解曲線を通過できますが、それでもコストがかかります。資金に余裕のない研究室では、大量のプライマーを入手した場合、通常の RT-PCR を使用して、それが単一のバンドであるかどうかを確認し、プライマーの特異性を特定できます。研究室に資金が不足していなければ、すべてのプライマーの特異性を融解曲線によって一度確認することができます。
4 実験条件が適切であると確信していますか?
SYBR は強い光から保護する必要があるため、SYBR 試薬を追加するときは頭上照明を消すようにし、完了には薄暗い光のみを使用する必要があります。
SYBR は 4°C で保存します。使用するときは、泡立ちを避けるために上下を静かに反転してよく混ぜ、激しくボルテックスしないでください。
妹の中には、サンプルが混ざることを恐れて PCR ボードにマークを描くことを好む人もいますが、これは間違いです。マーカーは蛍光シグナルの収集に影響を与える可能性が非常に高いため、私は通常、下に示すように、記憶を助けるために実験ノートを使用することをジュニアに推奨します。
形。qRT-PCRサンプルローディング図
5 本当に正しくやっているでしょうか？
必ず手袋をして、手袋をして、手袋をして、大事なことは3回言いましょう。
SYBR の露出を減らすために、個人的には、次の図に示すように、最初にテンプレートを追加するのが好きです。経験によれば、少量のテンプレートを追加すると、サンプリング エラーが発生する可能性があります。したがって、少量のテンプレートを追加することによって生じる誤差を最小限に抑えるために、通常はサンプルを再度 2 倍にし、サンプルを追加するときに 2 倍の量を加えて H2O2 の添加量を減らします。
形。qRT-PCRローディングの模式図
次に、以下のように qRT-PCR システムを構成します。
形。qRT-PCRシステム準備図
注: 設定プロセスは氷上で行う必要があります。
サンプル添加後、透明シールフィルムを貼り付けます。透明封止フィルムの表面には手を触れず、フィルムの両側の隙間から操作してください。指紋も蛍光シグナルの収集に影響を与える可能性があるためです。次に、遠心分離機を使用して、サンプルが壁に垂れ下がるのを防ぐために、低速で 10 秒間すばやく遠心分離します。
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投稿時間: 2023 年 4 月 28 日
