ニュース - ポピュラーサイエンス |qPCRで新型コロナウイルスを検出する方法

新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 型によって引き起こされる感染症です。人が感染すると、最も一般的な症状には発熱、咳、息切れなどがあります。

検査に使用されるサンプルは、鼻咽頭スワブまたは口腔咽頭スワブによって収集できます。

PCRとは何ですか？

コロナウイルス検出の標準的な方法はポリメラーゼ連鎖反応、PCR です。これは分子生物学で広く使用されている方法です。数百万から数十億の特定の DNA 断片を迅速にコピーできます。

新型コロナウイルスには非常に長い一本鎖RNAゲノムが含まれています。PCR によってこれらのウイルスを検出するには、RNA 分子を逆転写酵素によって相補的な DNA 配列に変換する必要があり、その後、新しく合成された DNA を標準的な PCR 手順（一般に RT-PCR として知られています）によって増幅できます。

RT-PCRプロセス

RNA抽出

この方法を実行するには、基本的にウイルス RNA を抽出する必要があります。さまざまな RNA 精製キットを使用して、便利で迅速かつ効果的な分離を行うことができます。

市販のキットを使用してウイルス RNA を抽出するには、まずサンプルを微量遠心管に加え、次にそれを溶解バッファーと混合します。この緩衝液は高度に変性されており、通常はフェノールとイソチオシアン酸グアニジンで構成されています。さらに、無傷のウイルス RNA を確実に分離するために、通常、RNase 阻害剤が溶解バッファー中に存在します。

溶解バッファーを加えた後、混合チューブをパルスでボルテックスし、室温でインキュベートします。次にウイルスは、溶解バッファーによる高度に変性する条件下で溶解されます。

サンプルが溶解した後、精製手順に遠心分離管が使用されます。サンプルは遠心分離管にロードされ、遠心分離されます。

この手順は、固定相がシリカゲルマトリックスからなる固相抽出法です。

最適な塩と pH 条件下では、RNA 分子がシリカ膜に結合します。

同時にタンパク質やその他の汚染物質も除去されます。

遠心分離後、遠沈管を清潔なコレクションチューブに入れ、ろ液を捨て、洗浄バッファーを加えます。

チューブを再度遠心分離機に置き、洗浄バッファーを膜に強制的に通過させます。これにより、残っている不純物がすべてメンブレンから除去され、シリカゲルに結合した RNA だけが残ります。

サンプルを洗浄した後、チューブを清潔な微量遠心管に入れ、溶出バッファーを加えます。

次に、遠心分離して溶出バッファーを膜に強制的に通過させます。溶出バッファーはスピンカラムからウイルス RNA を除去し、タンパク質、阻害剤、その他の汚染物質を含まない精製 RNA を取得します。

ステップ2

混合濃縮物

ウイルス RNA を抽出した後の次のステップは、PCR 増幅用の反応混合物を調製することです。この工程では濃縮液を使用します。この濃縮液は、プレミックス、逆転写酵素、ヌクレオチド、フォワードプライマー、リバースプライマー、TaqManプローブ、DNAポリメラーゼからなるプレミックス濃縮液です。

最後に、この反応混合物を完成させるために、RNA テンプレートを追加します。チューブをパルスボルテックスで混合し、反応混合物を PCR プレートにロードします。PCR プレートには通常 96 ウェルが含まれており、複数のサンプルを同時に分析できます。

ステップ3

PCR増幅

次に、プレートを PCR マシン (本質的にはサーマルサイクラー) に置きます。

リアルタイム RT-PCR は、RdrRP 遺伝子、E 遺伝子、N 遺伝子の標的配列を増幅することにより、2019 年の新型コロナウイルスを検出するために使用されます。標的遺伝子の選択は、プライマーとプローブの配列によって異なります。

RT-PCR の最初のステップは逆転写です。相補的 DNA の最初の鎖が合成されます。これは、ウイルス RNA ゲノムの相補的部分に結合する PCR リバースプライマーによって開始されます。次に、逆転写酵素がプライマーの 3' 末端に DNA ヌクレオチドを付加し、ウイルス RNA に相補的な DNA を合成します。このステップの温度と時間は、使用するプライマー、標的 RNA、および逆転写酵素によって異なります。

次に、最初の変性ステップが適用され、RNA-DNA ハイブリッドが変性されます。このステップは、DNA ポリメラーゼを活性化するために必要です。同時に逆転写酵素も失活します。

PCR は一連の熱サイクルで構成されます。各サイクルは、変性、アニーリング、および伸長のステップで構成されます。

変性ステップでは、反応チャンバーを摂氏 95 度に加熱し、それを二本鎖 DNA テンプレートの変性に使用します。

次のステップでは、反応温度を摂氏 58 度に下げ、フォワードプライマーを一本鎖 DNA テンプレートの相補部分にアニールさせます。アニーリング温度はプライマーの長さと組成に直接依存します。

伸長ステップでは、DNA ポリメラーゼが DNA テンプレート鎖に相補的な新しい DNA 鎖を合成します。テンプレートに相補的な遊離核を反応混合物から 5' から 3' 方向に加えることによって。このステップの温度は、使用する DNA ポリメラーゼによって異なります。

最初のサイクルの後、二本鎖 DNA ターゲットが得られます。

次に、第 2 サイクルに入ります。二本鎖 DNA が変性されて 2 つの一本鎖 DNA 分子が生成されます。

次のステップでは、反応温度を下げ、プライマーを各一本鎖 DNA テンプレートにアニールさせ、Taq-man プローブをターゲット DNA の相補部分にアニールさせます。

TaqMan プローブは、オリゴヌクレオチドプローブの 5' 末端に共有結合した蛍光団から構成されます。サイクラーの光源によって励起されると、蛍光色素分子が蛍光を発します。さらに、プローブは 3' 末端にクエンチャーから構成されています。レポーター遺伝子がクエンチャーに近接しているため、蛍光の検出が妨げられます。