Ct 値は蛍光定量 PCR の最も重要な結果表現形式です。遺伝子発現の差や遺伝子コピー数を計算するために使用されます。では、蛍光定量化の Ct 値はどれくらいが妥当と考えられるのでしょうか?Ct値の有効範囲を確保するにはどうすればよいですか？

Ct値とは何ですか？
qPCR 増幅プロセス中、増幅産物の蛍光シグナルが設定された蛍光閾値に達するときの、対応する増幅サイクル数 (サイクル閾値)。C はサイクルを表し、T はしきい値を表します。簡単に言うと、Ct 値は、初期テンプレートの増幅が qPCR における一定量の産物に達する時点に対応するサイクル数です。いわゆる「一定量の製品」については、後でさらに説明します。

Ct値は何をするのでしょうか？

1.指数関数的増幅とテンプレート量とCt値の関係
理想的には、qPCR の遺伝子は、特定のサイクル数後の指数関数的増幅によって蓄積されます。増幅サイクル数と産物量の関係は、増幅産物量 = 初期テンプレート量 × (1+En) サイクル数です。ただし、qPCR 反応は常に理想的な状況にあるわけではありません。増幅産物量が「ある産物量」に達すると、そのときのサイクル数がCt値となり、指数関数的増幅期となります。Ct 値と開始テンプレートの量の間の関係: テンプレートの Ct 値とテンプレートの開始コピー数の対数の間には線形関係があります。初期テンプレート濃度が高いほど、Ct 値は小さくなります。初期テンプレート濃度が低いほど、Ct 値は大きくなります。

2.増幅曲線、蛍光閾値および一定のPCR産物量
qPCR 増幅産物の量は、蛍光シグナル、つまり増幅曲線の形で直接表示されます。PCR の初期段階では、増幅は理想的な条件下にあり、サイクル数は少なく、生成物の蓄積も少なく、蛍光のレベルは蛍光バックグラウンドから明確に区別できません。その後、蛍光は増加し、指数関数期に入ります。PCR 反応がちょうど対数期にある特定の時点で PCR 産物の量を検出でき、これを「一定量の産物」として使用でき、これからテンプレートの初期含有量を推定できます。したがって、一定量の生成物に対応する蛍光シグナル強度が蛍光閾値となります。

PCR の後期段階では、増幅曲線は指数関数的な増幅を示さなくなり、直線相およびプラトー相に入ります。

3.Ct値の再現性
PCR サイクルが Ct 値のサイクル数に達すると、まさに真の指数関数的増幅期間に入ります。このとき、微小な誤差は増幅されていないため、同じテンプレートを異なる時間に、または異なるチューブで同時に増幅するため、Ct値の再現性が優れています。増幅により得られるCt値は一定です。

1.増幅効率En
PCR 増幅効率とは、ポリメラーゼが増幅される遺伝子をアンプリコンに変換する効率を指します。1 つの DNA 分子が 2 つの DNA 分子に変換されるときの増幅効率は 100% です。増幅効率は通常 En で表されます。以降の記事の分析を容易にするために、増幅効率に影響を与える要因を簡単に紹介します。

2.Ct値の範囲
Ct 値の範囲は 15 ～ 35 です。Ct 値が 15 未満の場合、増幅はベースライン期間の範囲内にあり、蛍光閾値に達していないと考えられます。理想的には、Ct 値とテンプレートの初期コピー数の対数、つまり標準曲線の間には直線関係があります。標準曲線により、増幅効率が 100% の場合、遺伝子の単一コピー数を定量するために計算される Ct 値は約 35 です。35 を超える場合、鋳型の初期コピー数は理論的には 1 未満となり、意味がないと考えられます。

遺伝子の Ct 範囲が異なると、遺伝子のコピー数と初期テンプレート量の増幅効率が異なるため、遺伝子の検量線を作成し、遺伝子の直線検出範囲を計算する必要があります。

3.Ct値に影響を与える要因
増幅サイクル数と産物の量の関係: 増幅産物の量 = 初期テンプレートの量 × (1+En) サイクル数から、理想的な条件下では、初期テンプレートの量と En が Ct 値に悪影響を与えることがわかります。テンプレートの品質または増幅効率の違いにより、Ct 値が大きすぎたり小さすぎたりすることがあります。

4.Ct値が大きすぎる、または小さすぎる