分子診断技術は、分子生物学の手法を使用して、人体やさまざまな病原体の遺伝物質の発現と構造を検出し、病気の予測と診断の目的を達成します。

近年、分子診断技術の進歩と反復に伴い、分子診断の臨床応用はますます広範かつ奥深くなり、分子診断市場は急速な発展期に入っています。

著者は市場で一般的な分子診断技術を要約しており、3 部に分かれています。第 1 部では PCR 技術を紹介し、第 2 部では核酸等温増幅技術を紹介し、第 2 部ではシーケンス技術を紹介します。

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パート I: PCR 技術

PCR技術

PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）は、30年以上の歴史を持つ生体外DNA増幅技術の一つです。

PCR 技術は、1983 年に米国シータスの Kary Mullis によって開発されました。マリスは 1985 年に PCR 特許を申請し、同年に初の PCR 学術論文をサイエンス誌に発表しました。マリスは1993年にノーベル化学賞を受賞した。

PCRの基本原理

PCR はターゲット DNA 断片を 100 万倍以上増幅できます。原理は、DNA ポリメラーゼの触媒作用の下で、親鎖 DNA が鋳型として使用され、特定のプライマーが伸長の開始点として使用されるというものです。これは、変性、アニーリング、伸長などのステップを通じて in vitro で複製されます。親鎖テンプレート DNA に相補的な娘鎖 DNA のプロセス。

標準的な PCR プロセスは 3 つのステップに分かれています。

1. 変性: 高温を使用して DNA 二本鎖を分離します。DNA二本鎖間の水素結合は高温(93～98℃)で切断されます。

2. アニーリング：二本鎖 DNA を分離した後、プライマーが一本鎖 DNA に結合できるように温度を下げます。

3. 伸長：温度が下がると、DNA ポリメラーゼは結合したプライマーから DNA 鎖に沿って相補鎖の合成を開始します。伸長が完了するとサイクルが完了し、DNA断片の数が2倍になります。

これら 3 つのステップを 25 ～ 35 回繰り返すと、DNA 断片の数が指数関数的に増加します。

PCR の巧妙な点は、標的遺伝子ごとに異なるプライマーを設計できるため、標的遺伝子断片を短時間で増幅できることです。

これまでのところ、PCR は通常の PCR、蛍光定量 PCR、デジタル PCR の 3 つのカテゴリに分類できます。

通常のPCRの第一世代

通常のPCR増幅装置を用いて目的遺伝子を増幅し、その後アガロースゲル電気泳動を用いて産物を検出するため、定性分析のみが可能です。

第一世代 PCR の主な欠点:

-非特異的増幅および偽陽性結果が発生しやすい。

・検出に時間がかかり、操作が煩雑である。

-定性的なテストのみが可能です。

第二世代蛍光定量PCR

qPCRとしても知られる蛍光定量PCR（リアルタイムPCR）は、反応系の進行を示すことができる蛍光プローブを添加することにより蛍光シグナルの蓄積を通じて増幅産物の蓄積を監視し、蛍光曲線を通じて結果を判断するために使用され、Cq値と標準曲線の助けを借りて定量することができます。

qPCR 技術は閉鎖系で実行されるため、汚染の可能性が低減され、定量的な検出のために蛍光シグナルを監視できるため、臨床現場で最も広く使用されており、PCR の主流の技術となっています。

リアルタイム蛍光定量 PCR で使用される蛍光物質は、TaqMan 蛍光プローブ、分子ビーコン、蛍光色素に分類できます。

1) TaqMan 蛍光プローブ:

PCR 増幅中に、一対のプライマーを追加する際に、特定の蛍光プローブが追加されます。プローブはオリゴヌクレオチドであり、両端がそれぞれレポーター蛍光基とクエンチャー蛍光基で標識されている。

プローブが損傷を受けていない場合、レポーターグループによって発せられる蛍光シグナルは消光グループによって吸収されます。PCR 増幅中、Taq 酵素の 5'-3' エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが切断および分解され、レポーター蛍光基とクエンチャーが形成されます。蛍光基は分離されるため、蛍光モニタリング システムは蛍光シグナルを受信できます。つまり、DNA 鎖が増幅されるたびに蛍光分子が形成され、蛍光シグナルの蓄積は PCR 産物の形成と完全に同期します。

2) SYBR 蛍光色素:

PCR反応系には過剰のSYBR蛍光色素が添加されます。SYBR 蛍光色素は、DNA 二本鎖に非特異的に組み込まれた後、蛍光シグナルを発します。鎖に組み込まれていない SYBR 色素分子は蛍光シグナルを発しないため、蛍光シグナルが確実に得られます。PCR 産物の増加は PCR 産物の増加と完全に同期します。SYBR は二本鎖 DNA にのみ結合するため、融解曲線を使用して PCR 反応が特異的かどうかを判断できます。

3) 分子ビーコン

5末端と3末端で約8塩基のヘアピン構造を形成するステムループ二重標識オリゴヌクレオチドプローブです。両端の核酸配列は相補的に対になっており、蛍光基と消光基が緊密になっています。近づけると蛍光を発しません。

PCR産物が生成された後、アニーリングプロセス中にモレキュラービーコンの中央部分が特定のDNA配列とペアになり、蛍光遺伝子がクエンチャー遺伝子から分離されて蛍光が発生します。

第二世代 PCR の主な欠点:

感度がまだ不足しており、低コピー検体の検出は正確ではありません。

バックグラウンド値の影響があり、結果は干渉を受けやすくなります。

第三世代デジタル PCR

デジタル PCR (DigitalPCR、dPCR、Dig-PCR) は、エンドポイント検出を通じてターゲット配列のコピー数を計算し、内部対照や標準曲線を使用せずに正確な絶対定量検出を実行できます。

デジタル PCR はエンドポイント検出を使用し、Ct 値（サイクル閾値）に依存しないため、増幅効率の影響を受けにくく、PCR 反応阻害剤に対する耐性が向上し、高い精度と再現性が得られます。

高感度・高精度という特徴により、PCR反応阻害剤による干渉を受けにくく、標準品を使用せずに真の絶対定量を実現できるため、研究・応用のホットスポットとなっています。

反応ユニットの形状の違いにより、マイクロ流体システム、チップシステム、液滴システムの 3 つのタイプに分類できます。