PCR反応の優れた特徴は、増幅能力が大きく、感度が非常に高いことです。PCR の性能と検出効率を向上させるために、私たちは PCR 増幅能力と検出感度の向上に取り組んでいますが、頭の痛い問題は実験の過程にあります。偽陽性は頻繁に発生し、非常に少量のサンプルの相互汚染または PCR 製品の汚染が実験で偽陽性を引き起こす可能性があります。
PCR産物のコンタミネーションは5種類
PCR コンタミネーションの原因は数多くありますが、大まかに次のカテゴリに分類できます。
検体の汚染は、主に検体を採取する容器の汚れや、検体を設置する際の密閉の緩みによる容器の外への漏れ、あるいは容器の外側に検体が付着することによる相互汚染が原因となります。汚染は試料間の汚染につながります。一部の微生物標本、特にウイルスは、エアロゾルで拡散したり、エアロゾルを形成したりして、相互汚染を引き起こす可能性があります。
主な理由は、PCR 試薬の調製中に、サンプルガン、容器、再蒸留水、その他の溶液が PCR 核酸テンプレートによって汚染されることです。
分子生物学の研究室や、クローン化プラスミドをポジティブコントロールとして使用する一部の研究室では、クローン化プラスミドの汚染の問題もよくあります。単位体積中のクローニングプラスミドの含有量が非常に多く、精製プロセスではより多くのツールや試薬が必要であり、また、生細胞内のプラスミドは、生細胞の強力な増殖および再生能力により汚染される可能性が非常に高いためです。
増幅産物の汚染は、PCR 反応における最も一般的な汚染問題です。PCR 産物のコピー量は多く (通常 1013 コピー/ml)、PCR 検出コピー数の限界をはるかに上回るため、微量の PCR 産物の混入が偽陽性を引き起こす可能性があります。
エアロゾル汚染は、PCR 製品の汚染の最も可能性の高い形態ですが、最も見落とされやすいものでもあります。液体表面と空気の間の摩擦によって形成されます。一般に、エアロゾル汚染は、蓋を開けたとき、サンプルを吸引したとき、または反応チューブを激しく振ったときでも発生する可能性があります。計算によると、エアロゾル粒子には 48,000 個のコピーが含まれる可能性があり、それによって引き起こされる汚染は特別な注意に値する問題です。
特に、検査機関は特定の遺伝子を検査するために同じプライマーのペアを使用することがよくあります。時間の経過とともに、実験室空間では大量の PCR 製品の汚染が発生します。このような汚れは一度発生すると短期間で除去することが困難です。
最初の 3 種類の汚染については、効果的な手段を使用して回避できますが、PCR 製品によって引き起こされる汚染は、特に非標準的な PCR 研究所の建設において防ぐのが困難です。PCR プロセスでは、ピペット チップが液体を吸引および吹き出し、PCR チューブのカバーが開くと、エアロゾルが形成されます。エアロゾルによって運ばれる DNA 分子 (1 つのエアロゾルには数万の DNA が運ばれる可能性があります) は空気中に浮遊するため、除去するのが困難です。次のラウンドの PCR 実験が導入されると、偽陽性が必然的に発生します。
以下の図に示すように、ネガティブ コントロールは、対応する対象のバンドも増幅しました。
PCR汚染と予防の問題の前編をここで紹介します。次回は後編「PCR産物のコンタミネーション防止編」をお届けしますので、お楽しみに！
投稿日時: 2017 年 7 月 25 日
