ダイレクト PCR は、核酸を抽出せずに動物または植物の組織を直接増幅に使用する反応です。多くの点で、ダイレクト PCR は通常の PCR と同様に機能します。

主な違いは、ダイレクト PCR で使用されるカスタムバッファーであり、核酸を抽出せずにサンプルを直接 PCR 反応にかけることができますが、酵素の耐性とダイレクト PCR 反応に関与するバッファーの適合性について、対応する要件があります。

一般的なサンプルには多かれ少なかれ PCR 阻害剤が含まれていますが、ダイレクト PCR は酵素と緩衝液の作用下でも信頼性の高い増幅を達成できます。従来のPCR反応では鋳型となる高品質な核酸が必要でしたが、鋳型にタンパク質などの不純物が含まれているとPCR反応がスムーズに進行しなくなることがありました。ダイレクト PCR は現在、分子診断の分野で最も人気のある技術の 1 つです。

01 ダイレクト PCR はもともと動物や植物に使用されていました

ダイレクト PCR の最も初期の応用は、ラット、ネコ、ニワトリ、ウサギ、ヒツジ、ウシなどの血液、組織および毛髪、植物の葉および種子などの動物および植物の分野であり、遺伝子型決定、トランスジェニック、プラスミド検出、遺伝子ノックアウト分析、DNA ソースの同定、種の同定、SNP 分析およびその他の分野の研究に使用されます。

これらの分野には共通の特徴があり、標的遺伝子の含有量が比較的多く、核酸抽出が面倒であるため、ダイレクトPCRは時間を節約でき、結果への影響が小さいだけでなく、コストも節約できます。

病原体検出にダイレクト PCR が使用されるようになったのは近年のことであり、一部の PCR 試薬メーカーはイノベーションを起こす際にこの方向に多くの努力を払っています。特にこの新型コロナウイルス感染症の流行では、Foregene が研究開発した SARS-CoV-2 核酸検出キット (多重 PCR 蛍光プローブ法) など、そのような検出製品が多数市場に登場しています。このキットは、ヒトの鼻咽頭または中咽頭のスワブサンプル中の SARS-CoV-2 核酸の定性的検出にリアルタイム RT PCR 技術 (rRT-PCR) を使用しています。

Foregene は、正常な ORF1ab、N、E、および変異体 SARS-CoV-2 B.1.1.7 系統 (UK)、B.1.351 系統 (ZA)、B.1.617 系統 (IND) および P.1 系統 (BR) などのヒト鼻咽頭または口腔咽頭ぬぐい液サンプル中の核酸系統。

02  ダイレクト PCR に必要な試薬

サンプルライセート

サンプル ライセートは自分で設定することも、購入することもできます。異なるブランドのライセートの組成の違いにより溶解能力が異なり、溶解時間もわずかに異なります。たとえば、動物組織サンプルの調製の場合、一般に 30 分または一晩の溶解が推奨され、ウイルスの溶解溶液は 3 ～ 10 分の範囲です。

PCRマスターミックス

特異的増幅を強化し、増幅能力を高めるために、ホットスタート DNA ポリメラーゼを使用することをお勧めします。ダイレクト PCR の中核となるのは、耐性の高いポリメラーゼです。

DNA増幅に影響を与えるサンプル中の成分を除去または阻害します

サンプルがライセートで処理された後、タンパク質、脂質、その他の細胞破片が放出され、これらの物質が PCR 反応を阻害します。したがって、直接 PCR では、これらの因子の影響を軽減するために、対応する除去剤または阻害剤を追加する必要があります。

03  ダイレクトPCRの5つの知識集

まず、ダイレクト PCR 技術は、さまざまな生体サンプルに対するダイレクト PCR 技術です。この技術条件では、核酸を分離抽出する必要がなく、組織サンプルを直接対象とし、標的遺伝子のプライマーを添加してPCR反応を行います。

第二に、ダイレクト PCR 技術は従来の DNA テンプレート増幅技術だけでなく、RNA テンプレート逆転写 PCR も含まれています。

第三に、ダイレクト PCR テクノロジーは、組織サンプルに対してルーチンの定性 PCR 反応を直接実行するだけでなく、リアルタイム qPCR 反応も含みます。これには、反応システムに強力な抗バックグラウンド蛍光干渉能力と内因性蛍光消光剤による拮抗能力が必要です。

第 4 に、ダイレクト PCR 技術の対象となるサンプルは核酸テンプレートの放出のみを必要とし、PCR 反応を妨げるタンパク質、多糖、塩イオンなどは除去しません。そのためには、複雑な条件下で酵素活性と複製精度を確保するために、反応系内の核酸ポリメラーゼと PCR ミックスが優れた耐性と適応性を備えている必要があります。

第五に、ダイレクトPCR技術の対象となる組織サンプルは核酸濃縮処理を一切行わず、鋳型量が非常に少ないため、反応系には極めて高い感度と増幅効率が求められます。