著者：王暁燕、趙禎龍

部署: 同済大学附属膠州病院、東方病院

現在、呼吸器病原体の核酸検出に使用される主なサンプルの種類は喉のスワブです。一般的に使用されるサンプル保存液にはさまざまな種類がありますが、輸送や保管にはすべて冷蔵または冷凍する必要があります。収集・輸送工程における低温の全工程管理が難しく、サンプル検査前の品質管理を確保することが困難^[1-2].

RNase (RNase) は RNA を加水分解するエンドヌクレアーゼで、主にヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断します。RNase 分子は非常に安定であり、構造中にジスルフィド結合があり、その活性には二価の陽イオンの存在を必要としないため、RNase は変性しにくく、高温や変性剤の使用後でも容易に復元します。RNase は内因性と外因性の RNase に分けられます。内在性 RNase は、細胞が破壊されると同時に放出されることがあります。したがって、内因性 RNase の役割を排除することは、RNA 抽出プロセスにおいて非常に重要なステップです。外因性 RNase は広く分布しています。RNase は空気、人間の皮膚、髪、唾液中に存在しており、これらが RNA を容易に分解する重要な理由となっています。^[3].

データクエリ

CANS-CL02-A009「分子診断分野における医療検査の品質および能力認定ガイドラインの適用」では、技術要件に応じて適切な水質基準を策定することが提案されています。使い捨て密閉容器：

RNase/分類

(1)RNaseA

ウシ膵臓由来のリボヌクレアーゼ A (RNase A) は、RNA 上のピリミジン残基の 3' 末端を特異的に攻撃し、隣接するヌクレオチドによって形成されるシトシンまたはウラシルを切断できるエンドリボヌクレアーゼです。ホスホジエステル結合、反応の最終生成物は 3' ピリミジン ヌクレオチドと、末端に 3' ピリミジン ヌクレオチドを持つオリゴヌクレオチドです。

(2) RNase T1

リボヌクレアーゼ T1 (RNase T1) はアスペルギルス オルジャエに由来し、グアニンの 3' 末端リン酸に特異的に作用し、切断部位はグアニンの 3' リン酸と隣接するヌクレオチドの 5' ヒドロキシルの間にあります。反応の最終生成物は、3'グアニル酸および末端に3'グアニル酸をもつオリゴヌクレオチドフラグメントです。

(3) RNase H

リボヌクレアーゼ H (RNase H) は子牛の胸腺組織から初めて発見され、そのコード遺伝子は大腸菌にクローニングされました。これは、RNA ハイブリッド二本鎖の DNA:RNA 鎖を特異的に分解し、3'-OH および 5'-一リン酸末端を持つオリゴヌクレオチドとモノヌクレオチドを生成しますが、一本鎖または二本鎖の DNA または RNA を分解することはできません。

RNase

機能と使い方

リボヌクレアーゼはリボ核酸 (RNA) の分解を触媒することができ、人工的に合成できます。薬用軟膏は、外傷や関節痛の治療に局所的に使用されます。報告によると、リボヌクレアーゼは宿主細胞の代謝を変化させ、ウイルス合成を阻害し、インビトロでのインフルエンザウイルスの増殖を阻害し、ニワトリ胚におけるワクシニアウイルスおよびヘルペスウイルスの形成を阻害することができる。リボヌクレアーゼの臨床使用は毎日 180 mg の筋肉内注射であり、流行性脳炎の治療に有益です。リボヌクレアーゼはリボ核酸 (RNA) の分解を触媒することができ、現在では人工的に合成することができます。薬用軟膏は、外傷や関節痛の治療に局所的に使用されます。報告によると、リボヌクレアーゼは宿主細胞の代謝を変化させ、ウイルス合成を阻害し、インビトロでのインフルエンザウイルスの増殖を阻害し、ニワトリ胚におけるワクシニアウイルスおよびヘルペスウイルスの形成を阻害することができる。リボヌクレアーゼの毎日 180 mg の筋肉内注射の臨床使用は、流行性脳炎の治療に有益です。

RNase

阻害剤の定義

RNase 阻害剤ユニットの定義: 5ng RNase A の活性の 50% を阻害するのに必要な酵素の量は 1 ユニットです。

RNase 阻害剤の仕組み

イソチオシアン酸グアニジン:

イソチオシアン酸グアニジンは、分子式 C2H6N4S の有機化合物です。主に生物医学、化学試薬などに使用されます。グアニジンイソチオシアネートはタンパク質の溶解剤であり、分子診断薬の溶解液の主成分としてよく使用されます。組織を溶解し、細胞構造を破壊し、核タンパク質から核酸を解離させることができ、RNase に対して強い変性を持ちます。現在のところ最も効果的なRNase阻害剤です。

TRIzol は、細胞や組織からトータル RNA を直接抽出できる新規なトータル RNA 抽出試薬です。これには、細胞を急速に破壊し、細胞から放出されるヌクレアーゼを阻害するフェノールやグアニジンイソチオシアネートなどの物質が含まれています。

(ただし、イソチオシアン酸グアニジンは研究者の健康にとって危険です。)

RNasin:

ラット肝臓またはヒト胚盤葉から抽出された酸性糖タンパク質。Rnasin は RNase の非競合的阻害剤であり、さまざまな RNase に結合してそれらを不活化することができます。

(詳細:https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

H高温:

高温もタンパク質変性の一般的な手段です。

ジエチルピロカーボネート (DEPC):

DEPC は強力ではあるが不完全な RNase 阻害剤であり、RNase 活性基のアミノ酸イミダゾール環と結合してタンパク質を変性させることによって RNase 活性を阻害できます。

バナジルリボヌクレオシド複合体:

酸化バナジウムイオンとヌクレオシドによって形成される複合体で、遷移物質の形でRNaseに結合し、RNaseの活性をほぼ完全に阻害します。

他の：

SDS、尿素、珪藻土などもRNaseに対して一定の阻害作用を持ちます。

専門家のレビュー

リー・ユジエ主任技術者

同済大学附属東方病院膠州病院検査部長

外因性 RNase の生分解を防ぐために、RNA 抽出プロセス中はマスク、手袋、帽子を着用し、頻繁に交換する必要があります。すべてのガラス製品は、乾燥オーブンで 200°C で 2 時間以上焼く必要があります。プラスチックなどのベーキングに使用される材料は、DEPC 水で処理した後、蒸留水で洗浄する必要があります。RNA の抽出、保存、同定に使用する試薬や装置は RNA 専用とし、独立した RNA 操作エリアを設置する必要があります。

参考文献:

[1] スミス・ヴォーン HC、ビンクス MJ、ベイスバース J 他オーストラリア先住民の子供における急性下気道感染症の発症直前の鼻咽頭内の細菌とウイルス[J]。Eur J Clin Microbiol Infect Dis、2018、37 (9): 1785-1794。

[2] 中国予防医学協会の病院感染管理支部。臨床微生物検体の収集と検査に関するガイドライン [J]。中国病院感染ジャーナル、2018(20):3192-3200。

[3]「臨床検査一万なぜ分子生物学検査の巻」