新型コロナウイルス感染症の流行の初期段階では、急速に進行しているため、感染が疑われる患者を迅速に診断することが新型コロナウイルス感染症を防ぐ鍵となります。既承認の核酸検出試薬の中には開発期間が短いものもあり、性能確認を急ぐ、試薬の最適化が不十分、バッチ間の差異が大きいなどの問題があり、核酸検出プロセスのさまざまな側面におけるさまざまな臨床検査室の問題も、核酸検出結果の精度に影響を与える可能性があります。この記事では、現在のSARS-CoV-2核酸検出における重要な関連性とポイントに焦点を当て、臨床検査における核酸検出の偽陰性および陽性の再検査と臨床的不一致の問題を分析します。
SARS-CoV-2 核酸検出の原理
SARS-CoV-2 は、約 29 kb のゲノム配列を持つ RNA ウイルスであり、10 個の遺伝子を持ち、10 個のタンパク質を効果的にコードすることができます。ウイルスはRNAとタンパク質で構成されており、最外層は脂質と糖タンパク質で構成される外皮です。内部ではタンパク質キャプシドが RNA を包み込み、それによって分解されやすい RNA (P1) を保護します。
P1 SARS-COV-2 の構造
ウイルスは、特定の細胞表面受容体を介して細胞に侵入して感染を引き起こし、宿主細胞を使用して複製します。
ウイルス核酸検出の原理は、細胞溶解物を通してウイルス RNA を露出させ、リアルタイム蛍光逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) を使用して検出することです。
検出原理の鍵となるのは、プライマーとプローブを用いて核酸配列の「ターゲットマッチング」、つまり他のウイルスと約3万塩基異なるSARS-CoV-2の核酸配列（他のウイルスとの核酸の類似性「低」領域）を見つけ、プライマーとプローブを設計することである。
プライマーおよびプローブは、SARS-CoV-2 核酸の特定領域と高度に一致しており、特異性が非常に強いです。検査対象のサンプルのリアルタイム蛍光 RT-PCR 増幅結果が陽性であれば、サンプル中に SARS-CoV-2 が存在することが証明されます。P2を参照してください。
SARS-CoV-2 核酸測定の P2 ステップ (リアルタイム蛍光 RT-PCR)
SARS-CoV-2 核酸検出のための検査室の条件と要件
核酸検査ラボは負圧環境に最も理想的であり、圧力監視、空気の流れの維持、エアロゾルの排除に注意を払う必要があります。核酸検査担当者は、対応する資格を持ち、関連するポリメラーゼ連鎖反応トレーニングを受け、評価に合格する必要があります。実験室は厳密に管理され、所定の場所に区画され、関係者以外の立ち入りは厳しく禁止されます。清潔なエリアは換気され、その場で消毒される必要があります。関連するアイテムはゾーンに配置され、きれいなアイテムと汚れたアイテムが分離され、時間通りに交換され、その場で除染されます。定期的な消毒: 塩素含有消毒剤は広い範囲の主な解決策であり、狭い範囲には 75% アルコールを使用できます。エアロゾルに対処する良い方法は、窓を開けて換気することです。また、紫外線、濾過、空気消毒によって空気消毒を行うこともできます。
SARS-CoV-2 核酸測定 (リアルタイム蛍光 RT-PCR) の主要なリンクとパラメーター
研究室は通常、核酸の「検出」に細心の注意を払っていますが、実際には、核酸の「抽出」も検出を成功させるための重要なステップの 1 つであり、ウイルス サンプルの収集と保管に密接に関連しています。
現在、鼻咽頭ぬぐい液などの呼吸器サンプルで最も広く使用されているのは、2 番目の方法である、核酸抽出および溶解溶液に基づいて調製された不活化 (保存) 溶液です。一方で、このウイルス保存溶液はウイルスのタンパク質を変性させ、その活性を失い、感染性を失うことができ、輸送および検出段階の安全性を向上させることができます。一方、ウイルスを直接分解して核酸を放出し、核酸分解酵素を除去してウイルスを阻止することもできます。RNA が分解されます。
核酸抽出溶解液をベースに調製したウイルス採取液です。主成分は平衡塩、エチレンジアミン四酢酸キレート剤、グアニジン塩（イソチオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジンなど）、陰イオン界面活性剤（ドデカン硫酸ナトリウム）、陽イオン界面活性剤（シュウ酸テトラデシルトリメチルアンモニウム）、フェノール、8-ヒドロキシキノリン、ジチオスレイトール、プロテイナーゼK、その他数種類以上コンポーネント。現在、核酸抽出キットには多くの種類があり、使用される核酸抽出・精製試薬も異なります。同じ核酸抽出精製試薬を使用しても、キットごとに抽出手順が異なります。
現在、国家医薬品局によって承認されている核酸検出キット製品は、SARS-CoV-2 ゲノムの ORF1ab、E、および N 遺伝子に基づいて選択されています。異なる製品の検出原理は基本的に同じですが、プライマーとプローブの設計が異なります。単一標的セグメント (ORF1ab)、二重標的セグメント (ORF1ab、N または E)、および 3 標的セグメント (ORF1ab、N および E) があります。検出と解釈、核酸抽出とリアルタイム蛍光 RT-PCR 反応システムの違いについては、関連するキットの説明書を参照する必要があり、ユーザーはキットの説明書に指定されている解釈方法に厳密に従って解釈することをお勧めします。リアルタイム蛍光RT-PCRによって増幅された共通領域、プライマーおよびプローブ配列をP3に示します。
P3 ゲノム上の SARS-CoV-2 アンプリコン標的の位置、およびプライマーとプローブの配列
SARS-CoV-2 核酸測定結果の解釈 (R食べる-Time蛍光RT-PCR)
「SARS-CoV-2 感染症に対する肺炎の予防および管理計画（第 2 版）」では、単一遺伝子増幅の結果を判断するための基準が初めて明確になりました。
1. Ct がない、または Ct≥40 は陰性です。
2. Ct<37 は陽性です。
3. Ct 値 37 ～ 40 はグレースケール領域です。実験を繰り返すことをお勧めします。Ct<40をやり直した結果、増幅曲線に明らかなピークがある場合、サンプルは陽性と判断され、そうでない場合は陰性と判断されます。」
ガイドの第 3 版とガイドの第 4 版では、上記の基準が継続されました。しかし、市販のキットでは異なるターゲットが使用されているため、前述のガイドの第 3 版では、ターゲットの組み合わせを決定するための基準が示されておらず、製造業者が提供する指示が優先されることが強調されています。ガイドラインの第5版からは2つの対象が明確になり、特に判断が難しい単一の対象の判断基準が明確になりました。つまり、検査機関が症例が SARS-CoV-2 核酸検出陽性であることを確認したい場合は、以下の 2 つの条件のうち 1 つを満たす必要があります。
(1) 同じサンプル内の SARS-CoV-2 の 2 つのターゲット (ORF1ab、N) が、リアルタイム蛍光 RT-PCR で陽性と判定されました。単一のターゲットが陽性の場合は、再サンプリングと再検査が必要です。検査結果が 1 つのターゲットが依然として陽性であれば、陽性と判断されます。
(2) リアルタイム蛍光 RT-PCR の 2 つのサンプルが同時に単一ターゲット陽性を示した場合、または同じ種類の 2 つのサンプルが単一ターゲット陽性の検査結果を示し、陽性と判断できます。しかし、ガイドラインでは、核酸検査の陰性結果はSARS-CoV-2感染を排除できないことも強調している。偽陰性を引き起こす可能性のある要因を除外する必要があります。これには、サンプルの品質が悪い（中咽頭やその他の部分からの呼吸器サンプル）、サンプル収集が早すぎるか遅すぎる、サンプルが正しく保管、輸送、処理されていない、技術自体に問題がある（ウイルスの変異、PCR 阻害）などが含まれます。
SARS-CoV-2 検出における偽陰性の原因
現在問題となっている核酸検査における「偽陰性」という概念は、核酸検査の結果が臨床症状と一致しない、つまり臨床症状や画像結果が新型コロナウイルス感染症の疑いが濃厚である「偽陰性」を指すことが多いが、核酸検査では常に「陰性」となることが何度もある。国家衛生健康委員会の臨床検査センターは、「偽陰性」SARS-CoV-2検査について説明した。
(1)感染者の細胞内には一定量のウイルスが存在します。既存のデータによると、体がウイルスに感染した後、ウイルスは鼻や口を通って喉に入り、気管や気管支を経て肺胞に到達する。感染者は潜伏期間、軽度の症状を経て、その後重篤な症状に至る過程と、さまざまな病気の段階を経験します。そして体の各部位に存在するウイルスの量も異なります。
細胞種のウイルス量としては、肺胞上皮細胞（下気道）＞気道上皮細胞（上気道）＞線維芽細胞、内皮細胞、マクロファージ等。サンプルの種類から、肺胞洗浄液（最も優れたもの）>深い咳喀痰>鼻咽頭スワブ>中咽頭スワブ>血液。さらに、ウイルスは糞便からも検出される可能性があります。しかし、手術の利便性と患者の受け入れを考慮して、一般的に使用される臨床サンプルの順序は、口腔咽頭スワブ＞鼻咽頭スワブ＞気管支洗浄液（複雑な手術）および深部の痰（通常は空咳であり、入手が困難）である。
したがって、一部の患者の中咽頭または鼻咽頭の細胞内のウイルスの量は少ないか、または非常に少ないです。検査のために中咽頭または鼻咽頭のサンプルのみが採取された場合、ウイルス核酸は検出されません。
(2) サンプル収集中にウイルスを含む細胞が収集されなかったか、ウイルス核酸が効果的に保存されませんでした。
［①口腔咽頭ぬぐい液を採取する際に採取深さが足りない、鼻咽頭ぬぐい液が鼻腔の奥まで採取されていないなど、採取部位が不適切である。採取された細胞のほとんどがウイルスを含まない細胞である可能性がある。
②採取綿棒の使い方が間違っている。例えば、スワブヘッドの材質としては、ＰＥ繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維等の合成繊維が推奨される。実際の作業では、綿などの天然繊維（タンパク質の吸着力が強く、落ちにくい）やナイロン繊維（吸水性が悪く、サンプリング量が不十分）が使用されます。
③核酸（DNA・RNA）を吸収しやすいポリプロピレンやポリエチレン製のプラスチック製保存管を誤って使用するなど、ウイルス保存管の誤った使用により、保存液中の核酸濃度が低下する。実際には、ウイルス核酸を保存するために、ポリエチレン - プロピレン ポリマー プラスチックおよびいくつかの特別に処理されたポリプロピレン プラスチック容器を使用することが推奨されます。】
［①口腔咽頭ぬぐい液を採取する際に採取深さが足りない、鼻咽頭ぬぐい液が鼻腔の奥まで採取されていないなど、採取部位が不適切である。採取された細胞のほとんどがウイルスを含まない細胞である可能性がある。
②採取綿棒の使い方が間違っている。例えば、スワブヘッドの材質としては、ＰＥ繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維等の合成繊維が推奨される。実際の作業では、綿などの天然繊維（タンパク質の吸着力が強く、落ちにくい）やナイロン繊維（吸水性が悪く、サンプリング量が不十分）が使用されます。
③核酸（DNA・RNA）を吸収しやすいポリプロピレンやポリエチレン製のプラスチック製保存管を誤って使用するなど、ウイルス保存管の誤った使用により、保存液中の核酸濃度が低下する。実際には、ウイルス核酸を保存するために、ポリエチレン - プロピレン ポリマー プラスチックおよびいくつかの特別に処理されたポリプロピレン プラスチック容器を使用することが推奨されます。】
(4) 臨床検査業務は標準化されていない。サンプルの輸送および保管条件、臨床検査室の標準化された操作、結果の解釈および品質管理は、検査結果の正確性と信頼性を確保するための重要な要素です。国家衛生健康委員会臨床検査センターが2020年3月16～24日に実施した外部品質評価の結果によると、有効な結果を得た844の検査施設のうち、701施設（83.1％）が資格を取得し、143施設（16.9％）が不合格となった。資格があり、全体的な検査室の検査条件は良好ですが、検査室ごとに担当者の操作能力、単一標的陽性サンプルの解釈能力、および品質管理には依然として差があります。
SARS-CoV-2 核酸検出の偽陰性を減らすにはどうすればよいですか?
核酸検出における偽陰性の低減は、偽陰性の生成に関する 4 つの側面から最適化する必要があります。
(1)感染者の細胞内には一定量のウイルスが存在します。感染が疑われる人の体のさまざまな部分におけるウイルスの濃度は、時間ごとに異なります。咽頭がない場合は、気管支洗浄液または糞便中に存在している可能性があります。検査のために複数の種類のサンプルを同時に、または病気の進行の異なる段階で収集できれば、偽陰性を回避するのに役立ちます。
(2) ウイルスを含む細胞はサンプル採取時に採取する必要があります。この問題は、サンプル収集者のトレーニングを強化することで大幅に解決できます。
(3) 信頼性の高い IVD 試薬。国家レベルで試薬の検出性能評価に関する研究を実施し、現状の課題を議論することで、試薬の検出効率をさらに向上させ、分析感度を向上させることができる。
(4) 臨床検査室の標準化された運営。検査員のトレーニングを強化し、検査室の品質管理システムを継続的に改善し、合理的な部門を確保し、検査員の検出能力を向上させることで、不適切な検査室の運営による偽陰性を減らすことができます。
回復および退院した患者におけるSARS-CoV-2核酸検査の再検査陽性の理由
「新型コロナウイルス感染症の診断と治療計画（治験第七版）」では、新型コロナウイルス感染症患者が治癒して退院するための基準の一つとして、連続する2回の気道サンプルの核酸検査が陰性（少なくとも24時間間隔）であることが明記されているが、退院患者でSARS-CoV-2の核酸検査が再び陽性となった例は、さまざまな理由により非常に少ない。
(1)SARS-CoV-2は新しいウイルスです。その発症メカニズム、引き起こされる病気の全体像、病気の経過の特徴をさらに理解する必要があります。したがって、一方では退院患者の管理を強化し、14日間の医学的観察を行う必要がある。病気の発生・進行・転帰の全過程について理解を深めるためのフォローアップ、健康観察、保健指導を実施します。
(2)再度ウイルスに感染する可能性があります。学会員の鍾南山氏は、「治癒した患者は抗体を持っているため、SARS-CoV-2が再び侵入した場合には抗体によって排除できる」と述べた。回復した患者の原因である可能性もあれば、ウイルスの変異に関連している可能性もあり、さらには臨床検査の原因である可能性もあるなど、さまざまな理由が考えられます。ウイルス自体である場合、SARS-CoV-2の変異により、回復した患者が産生する抗体が変異ウイルスに対して無効になる可能性があります。患者が変異ウイルスに再び感染すると、核酸検査で再び陽性反応が出る可能性がある。
(3)臨床検査法に関しては、それぞれの検査法には限界があります。SARS-CoV-2 核酸の検出は、遺伝子配列の選択、試薬の組成、方法の感度、その他の理由により行われるため、既存のキットの検出限界は低くなります。患者が治療を受けると、体内のウイルスが減少します。検査対象のサンプル中のウイルス量が検出下限値を下回る場合、「陰性」の結果が表示されます。ただし、この結果は体内のウイルスが完全に消滅したことを意味するものではありません。治療を中止した後にウイルスが感染している可能性があります。復活」をコピーし続けます。したがって、退院後 2 ～ 4 週間以内に週に 1 回見直すことをお勧めします。
(4) 核酸はウイルスの遺伝物質です。患者が抗ウイルス治療を受けるとウイルスは死滅しますが、残ったウイルスのRNA断片は体内に残り、完全には体外に排出されません。場合によっては、特定の状況下では、より保持されることがあります。長い時間がかかり、現時点では核酸検査は「一時的」陽性となります。患者の回復時間が延長するにつれて、体内の残留RNA断片が徐々に使い果たされた後、核酸検査の結果が陰性になる可能性があります。
(5) SARS-CoV-2の核酸検査結果は、ウイルスRNAの有無を証明するだけであり、ウイルスの活性やウイルスの感染力の有無は証明できない。核酸検査で再び陽性となった患者が再び感染源となるかどうかを証明する必要がある。感染性を証明するには、臨床サンプルでウイルス培養を実施し、「生きた」ウイルスを培養する必要があります。
まとめ
要約すると、SARS-CoV-2 核酸検査の偽陰性、再検査陽性、および臨床症状と一致しないその他の状態を完全に回避することはできません。実際のスクリーニングや検査では、見逃しや誤診を防ぐため、臨床症状、画像検査（CT）、臨床検査（核酸検査＋ウイルス特異抗体検査）の結果を組み合わせて総合的に診断することが推奨されています。検査結果が臨床症状と明らかに矛盾していることが判明した場合は、SARS-CoV-2ウイルスの初期感染、再発感染、または他の呼吸器ウイルス感染症との組み合わせなどの可能性を排除するために、検査リンク全体（サンプル収集、流通、処理リンク）の包括的な分析を実施することが推奨されます。状況が許せば、再検査のために喀痰や肺胞洗浄液などのより感度の高いサンプルを採取することをお勧めします。
関連製品：
SARS-CoV-2核酸検出キット（マルチプレックスPCR蛍光プローブ法）
投稿時間: 2021 年 9 月 3 日
