出発物質: RNA
定量的逆転写 PCR (RT-qPCR) は、出発物質として RNA を使用する PCR 実験に使用される実験方法です。この方法では、まず総 RNA またはメッセンジャー RNA (mRNA) が逆転写酵素によって相補的 DNA (cDNA) に転写されます。続いて、cDNAを鋳型として用いてqPCR反応を行った。RT-qPCR は、遺伝子発現解析、RNA 干渉検証、マイクロアレイ検証、病原体検出、遺伝子検査、疾患研究などのさまざまな分子生物学のアプリケーションで使用されています。
RT-qPCR の 1 ステップ法と 2 ステップ法
RT-qPCR は、1 ステップまたは 2 ステップの方法で実行できます。ワンステップ RT-qPCR では、逆転写と PCR 増幅が組み合わされており、逆転写酵素と DNA ポリメラーゼが同じバッファー条件下、同じチューブ内で反応を完了することができます。ワンステップ RT-qPCR では、配列特異的プライマーの使用のみが必要です。ツーステップ RT-qPCR では、異なる最適化されたバッファー、反応条件、プライマー設計戦略を使用して、2 つのチューブで逆転写と PCR 増幅が実行されます。
アドバンテージ | 不利益 | |
ワンステップ | この方法では両方の反応が 1 つのチューブで行われるため、実験誤差が少なくなります。
ピペット操作のステップが減り、汚染のリスクが軽減されます。
ハイスループットの増幅/スクリーニングに適しており、高速かつ再現性が高い | 2 段階の反応を個別に最適化することはできません
2段階反応を組み合わせることで反応条件が損なわれるため、2段階法に比べ感度は劣ります。
1つのサンプルで検出されるターゲットの数が少ない |
2 つのステップ | 長期間保存でき、複数の反応で使用できる安定した cDNA ライブラリを作成する機能
複数の cDNA ライブラリを必要とせず、ターゲット遺伝子と参照遺伝子を同じ cDNA ライブラリから増幅できます。
単一反応実行の最適化を可能にする反応バッファーと反応条件
トリガー条件を柔軟に選択可能 | 複数のチューブを使用し、ピペット操作の手順が増えると、DNA 汚染のリスクが高まります。 そして時間がかかります。
ワンステップ方式よりも多くの最適化が必要 |
関連製品:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (ワンステップ)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (ワンステップ)-Taqman
RT Easyᵀᴹ 第一鎖 CDNA 合成用のマスター プレミックス
リアルタイム PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I キット
total RNA と mRNA の選択
RT-qPCR 実験を設計する場合、逆転写のテンプレートとして全 RNA を使用するか精製 mRNA を使用するかを決定することが重要です。mRNA はわずかに高い感度を提供できる可能性がありますが、依然としてトータル RNA が頻繁に使用されます。その理由は、出発物質としてトータル RNA の方が mRNA よりも重要な利点があるためです。まず、このプロセスに必要な精製ステップが少なくなり、テンプレートの定量的回収が向上し、開始細胞数に対する結果の正規化が向上します。第 2 に、mRNA 濃縮ステップが回避され、異なる mRNA の異なる回収によって生じる結果が歪む可能性を回避できます。全体として、ほとんどのアプリケーションでは、検出の絶対感度よりも標的遺伝子の相対定量の方が重要であるため、ほとんどの場合、トータル RNA の方が適しています。
逆転写プライマー
2 ステップ法では、オリゴ (dT) プライマー、ランダム プライマー、または配列特異的プライマーの 3 つの異なる方法を使用して cDNA 反応をプライミングできます。通常、オリゴ(dT)プライマーとランダムプライマーを組み合わせて使用します。これらのプライマーはテンプレート mRNA 鎖にアニールし、逆転写酵素に合成の開始点を提供します。
プライマーの選択 | 構造と機能 | アドバンテージ | 不利益 |
オリゴ(dT)プライマー (またはアンカーオリゴ(dT)プライマー) | mRNA のポリ (A) テールのチミン残基への拡張アニーリング。アンカーオリゴ(dT)プライマーは、3'末端(アンカー部位)にG、C、またはAを含みます。 | ポリ(A)テールmRNAからの完全長cDNAの合成
利用可能な出発物質が少ない場合に適用可能
アンカー部位により、オリゴ(dT)プライマーがmRNAの5'ポリ(A)テールに確実に結合します。 | ポリ(A)テールを持つ遺伝子の増幅にのみ適しています
ポリ(A)のプライミングサイト*2から切断されたcDNAを取得
3'末端に結合するようにバイアス*
*アンカーオリゴ(dT)プライマーを使用すると、この可能性は最小限に抑えられます。 |
ランダムプライマー
| 長さは 6 ~ 9 塩基で、RNA 転写中に複数の部位にアニールすることができます。 | すべての RNA (tRNA、rRNA、mRNA) にアニールします
重要な二次構造を持つ転写物、または利用可能な出発物質が少ない場合に適しています
高いcDNA収量 | cDNA はすべての RNA から逆転写されますが、これは通常望ましくなく、標的 mRNA のシグナルを弱める可能性があります。
切断されたcDNAを取得する |
配列特異的プライマー | 特定のmRNA配列をターゲットとするカスタムプライマー | 特定のcDNAライブラリー
感度の向上
リバース qPCR プライマーの使用 | 単一の標的遺伝子の合成のみに限定される |
逆転写酵素
逆転写酵素は、RNA を使用して DNA を合成する酵素です。一部の逆転写酵素は RNase 活性を有し、転写後に RNA-DNA ハイブリッド鎖の RNA 鎖を分解する可能性があります。RNase 酵素活性がない場合は、qPCR 効率を高めるために RNaseH を追加できます。一般的に使用される酵素には、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素や鳥骨髄芽腫ウイルス逆転写酵素などがあります。RT-qPCR では、より高い温度で cDNA 合成を実行できるように、より高い熱安定性を備えた逆転写酵素を選択することが理想的です。これにより、より高い二次構造をもつ RNA の転写が確実に成功すると同時に、反応全体を通じて完全な活性が維持され、より高い cDNA 収量が得られます。
関連製品:
逆転写酵素のRNase H活性
RNaseH は RNA-DNA 二重鎖から RNA 鎖を分解することができ、二本鎖 DNA の効率的な合成を可能にします。ただし、長い mRNA を鋳型として使用すると、RNA が早期に分解され、cDNA が切断される可能性があります。したがって、長い転写物の合成が必要な場合は、cDNA クローニング中に RNaseH 活性を最小限に抑えることが有益であることがよくあります。対照的に、RNase H 活性を持つ逆転写酵素は、PCR の最初のサイクルで RNA-DNA 二重鎖の融解を促進するため、qPCR アプリケーションに有益であることがよくあります。
プライマー設計
RT-qPCR の qPCR ステップに使用される PCR プライマーは、理想的にはエクソン-エクソン接合部にまたがるように設計する必要があり、増幅プライマーは実際のエクソン-イントロン境界にまたがる可能性があります。イントロンを含むゲノム DNA 配列は増幅されないため、この設計により、汚染されたゲノム DNA から増幅される偽陽性のリスクが軽減されます。
エクソンまたはエクソン-エクソン境界を分離するようにプライマーを設計できない場合は、ゲノム DNA 汚染を除去するために RNase フリー DNase I または dsDNase で RNA サンプルを処理する必要がある場合があります。
RT-qPCR コントロール
DNA コンタミネーション (ゲノム DNA や以前の反応による PCR 産物など) を検出するには、すべての RT-qPCR 実験に逆転写ネガティブ コントロール (-RT コントロール) を含める必要があります。このコントロールには、逆転写酵素を除くすべての反応コンポーネントが含まれています。このコントロールでは逆転写が起こらないため、PCR 増幅が観察された場合は DNA からの汚染が考えられます。
投稿時間: 2022 年 8 月 2 日