私の記憶にある検出技術の歴史における革新的な発明は、抗原抗体特異的結合原理に基づく免疫標識技術、PCR技術、シーケンシング技術です。今日はPCR技術についてお話します。PCR技術の進化に応じて、人々は習慣的にPCR技術を通常のPCR技術、リアルタイム蛍光定量PCR技術、デジタルPCR技術の3世代に分けています。
C一般的なPCR技術
ケイリー・マリス (1944.12.28-2019.8.7)
キャリー・マリスは1983年にポリメラーゼ連鎖反応(ポリメラーゼ連鎖反応、PCR)を発明しました。彼はガールフレンドを運転していたときに突然ひらめき、PCRの原理(運転の利点について)を思いついたと言われています。キャリー・マリスは1993年にノーベル化学賞を受賞し、ニューヨーク・タイムズ紙は次のようにコメントした：「生物学をPCR以前とPCR後の時代にほぼ分けているほど、非常に独創的かつ重要である。
PCR の原理: DNA ポリメラーゼの触媒作用の下、母鎖 DNA を鋳型として使用し、特定のプライマーを伸長の開始点として使用し、母鎖鋳型 DNA に相補的な娘鎖 DNA を変性、アニーリング、伸長などのステップを経て in vitro でコピーします。これは、あらゆる標的 DNA を in vitro で迅速かつ特異的に増幅できる、in vitro での DNA 合成増幅技術です。
通常のPCRのメリット
1.古典的な手法、完全な国際および国内標準
2.機器試薬のコスト削減
3.PCR産物は他の分子生物学実験のために回収可能
推奨 Foregene PCR マシン: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
関連製品：https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
通常のPCRのデメリット
1.汚れやすい
2.面倒な操作
3.定性分析のみ
4.中程度の感度
5.非特異的な増幅があり、非特異的なバンドが目的のバンドと同じサイズの場合、区別できません
Cアピラリー電気泳動ベースの PCR
通常の PCR の欠点に対応して、一部のメーカーはキャピラリー電気泳動の原理に基づいた装置を導入しています。PCR増幅後の電気泳動ステップはキャピラリー内で完了します。感度が高く、数塩基の違いを区別でき、MAERKER により増幅を計算できます。商品内容。欠点は、PCR 産物を開いて装置に入れる必要があり、依然として汚染のリスクが大きいことです。
C毛細管E電気泳動
2. リアルタイム蛍光定量PCR（Quantitative Real-time PCR、qPCR）技術リアルタイム PCR とも呼ばれる蛍光定量 PCR は、1995 年に PE (Perkin Elmer) によって開発された新しい核酸定量技術です。蛍光定量 PCR の開発の歴史は、ABI、Roche、Bio-Rad などの巨人の魂を揺さぶる闘争の歴史です。興味のある方はぜひチェックしてみてください。この技術は現在最も成熟しており、広く使用されている半定量 PCR 技術です。
推奨 qPCR マシン:https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
蛍光色素法（SYBR Green I）：SYBR Green I は、定量的 PCR に最も一般的に使用される DNA 結合色素であり、二本鎖 DNA に非特異的に結合します。遊離状態では、SYBR Green は弱い蛍光を発しますが、二本鎖 DNA に結合すると、その蛍光は 1000 倍に増加します。したがって、反応によって発せられる総蛍光シグナルは、存在する二本鎖 DNA の量に比例し、増幅産物の増加とともに増加します。色素は二本鎖 DNA に非特異的に結合するため、偽陽性の結果が生じる可能性があります。
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蛍光プローブ法（Taqmanテクノロジー）：PCR 増幅では、特定の蛍光プローブがプライマーのペアと同時に追加されます。プローブは直鎖状のオリゴヌクレオチドで、両端に蛍光レポーター基と蛍光クエンチャー基がそれぞれ標識されています。プローブが無傷である場合、レポーターグループによって発せられる蛍光シグナルはクエンチャーグループによって吸収され、検出には蛍光シグナルは存在しません。PCR増幅中（伸長段階）、Taq酵素の5'-3'ダイサー活性によりプローブが消化・分解されるため、レポーター蛍光基とクエンチャー蛍光基が分離され、蛍光モニタリングシステムが蛍光シグナルを受信できるようになります。つまり、DNA鎖が増幅されるたびに蛍光分子が形成され、蛍光シグナルの蓄積とPCR産物の形成が完全に同期します。Taqman プローブ法は、臨床検出で最も一般的に使用される検出法です。
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qPCR の利点
1.メソッドは成熟しており、サポートする機器と試薬は完備されています
2.試薬のコストが中程度
3.使いやすい
4.高い検出感度と特異性
qPCR の欠点
標的遺伝子の変異は検出漏れにつながります。
低濃度テンプレートの検出結果は判定できません。
定量的検出に標準曲線を使用する場合、大きな誤差が生じます。
3.デジタルPCR（デジタルPCR、dPCR）技術
デジタル PCR は、核酸分子を絶対定量するための技術です。qPCR と比較すると、デジタル PCR は DNA/RNA 分子の数を直接読み取ることができ、これは出発サンプル中の核酸分子の絶対定量です。1999 年に、Bert Vogelstein と Kenneth W. Kin-zler が dPCR の概念を正式に提案しました。
2006 年、Fluidigm は初めて商用チップベースの dPCR 装置を製造しました。2009 年、Life Technologies は OpenArray および QuantStudio 12K Flex dPCR システムを発売しました。2013 年、Life Technologies は、高密度ナノスケールのマイクロ流体チップ技術を使用してサンプルを 20,000 個の個々の細胞に均一に分配する QuantStudio 3DdPCR システムを発売しました。反応良好です。
2011 年、バイオ・ラッドは液滴ベースの QX100 dPCR 装置を発売しました。この装置は、油中水滴技術を使用してサンプルを 20,000 個の油中液滴に均一に分配し、液滴アナライザーを使用して液滴を分析します。2012 年、RainDance は、高圧ガスによって駆動される RainDrop dPCR 装置を発売し、各標準反応システムを 100 万から 1,000 万ピコリットル レベルの微小液滴を含む反応エマルジョンに分割しました。
これまでのところ、デジタル PCR はチップ型とドロップレット型の 2 つの主要な派閥を形成しています。どのような種類のデジタル PCR であっても、その中心原則は限界希釈、エンドポイント PCR、およびポアソン分布です。核酸テンプレートを含む標準的な PCR 反応系は、各反応に可能な限り多くのテンプレート分子が含まれるように、数万の PCR 反応に均等に分割され、チップまたは微小液滴に分配され、単一分子テンプレート PCR 反応が実行されます。蛍光を読み取ることでシグナルの有無をカウントし、統計的ポアソン分布を校正した上で絶対定量を行います。
以下は、私が使用したいくつかのデジタル PCR プラットフォームの特徴です。
1. Bio-Rad QX200 ドロップレット デジタル PCR Bio-RadQX200 は非常に古典的なデジタル PCR プラットフォームで、基本的な検出プロセスは次のとおりです。液滴生成器によって 20,000 個のサンプルが生成されます。油中水の微小液滴が通常の PCR マシンで増幅され、最後に各微小液滴の蛍光シグナルが微小液滴リーダーによって読み取られます。操作はより複雑で、汚染のリスクは中程度です。
Xinyi TD1 マイクロドロップレットデジタル PCRXinyi TD1は国産のデジタルPCRプラットフォームで、基本的な検出プロセスは、液滴発生器を通じて30,000～50,000個の油中水滴を生成し、一般的なPCR装置で増幅し、最後に液滴リーダーで各液滴の蛍光シグナルを読み取ります。このプラットフォームでの液滴の生成と読み取りは両方とも、汚染のリスクが低い専用チップで実行されます。
STILLA Naica マイクロドロップレットチップデジタル PCRSTILLA Naica は、比較的新しいデジタル PCR プラットフォームです。基本的な検出プロセスは、反応溶液をチップに加え、チップを微小液滴生成および増幅システムに入れ、30,000 個の微小液滴を生成します。チップ上に展開し、チップ上でPCR増幅が完了します。次に、増幅されたチップを微小液滴読み取り解析システムに移し、写真を撮ることで蛍光シグナルを読み取ります。プロセス全体が密閉されたチップ内で行われるため、汚染のリスクは低くなります。
4. ThermoFisher QuantStudio 3D チップ デジタル PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D は、もう 1 つの古典的なチップベースのデジタル PCR プラットフォームです。基本的な検出プロセスは、反応液をスプレッダーに加え、スプレッダーを通して 20,000 個のマイクロウェルを備えたチップ上に反応液を均一に広げるというものです。、チップをPCR装置に置いて増幅し、最後にチップをリーダーに置き、写真を撮って蛍光シグナルを読み取ります。操作は比較的複雑で、プロセス全体は密閉チップ内で実行され、汚染のリスクは低いです。
5. JN MEDSYS ClarityチップデジタルPCR
JN MEDSYS Clarity は比較的新しいチップ型デジタル PCR プラットフォームです。基本的な検出プロセスは、反応液をアプリケーターに加え、アプリケーターを通して PCR チューブに固定された 10,000 本の PCR チューブ上に反応液を均一に展開します。微多孔性チップ上では、反応溶液が毛細管現象によってチップ内に入り、チップの入ったPCRチューブをPCR装置に置いて増幅させ、最後にチップをリーダーにセットして写真を撮って蛍光シグナルを読み取ります。操作はさらに複雑になります。汚染のリスクは低いです。
各デジタル PCR プラットフォームのパラメーターは次のように要約されます。
デジタル PCR プラットフォームの評価指標は、スプリットユニットの数、蛍光チャンネルの数、操作の複雑さ、コンタミネーションのリスクです。しかし、最も重要なことは検出精度です。デジタル PCR プラットフォームを評価する 1 つの方法は、複数のデジタル PCR プラットフォームを使用して相互に検証することです。もう 1 つの方法は、正確な値を持つ標準物質を使用することです。
dPCR の利点
1.絶対定量化の実現
2.より高い感度と特異性
3.低コピーサンプルを検出可能
dPCR の欠点1. 高価な装置と試薬 2. 複雑な操作と長い検出時間 3. 狭い検出範囲
現在、3 世代の PCR 技術にはそれぞれ長所と短所があり、それぞれ独自の応用分野があり、ある世代が他の世代に置き換わるという関係ではありません。技術の継続的な進歩により、PCR 技術に新たな活力が注入され、次々と応用方向が解き放たれ、核酸検出がより便利かつ正確になりました。
出典: ユアン博士があなたを検査に連れて行きます
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投稿日時: 2022 年 11 月 18 日
